发明名称 |
制备交联NAMPT及筛选NAMPT抑制剂的方法 |
摘要 |
本发明公开了一种制备交联NAMPT及筛选NAMPT抑制剂的方法,涉及抑制剂领域,包括以下步骤:制备NAMPT重组蛋白,使用还原剂还原NAMPT重组蛋白,还原蛋白与交联剂反应获得活性中心被封堵的交联NAMPT,配置第一蛋白溶液、和第二蛋白溶液,制备第一待分析溶液、第一对照溶液、第二待分析溶液和第二对照溶液,采用荧光光谱仪分别测定第一待分析溶液、第一对照溶液、第二待分析溶液和第二对照溶液的荧光强度,并计算第一待分析溶液和第二待分析溶液荧光强度下降的百分率。本发明的步骤比较少,操作较简单,成本比较低,反应过程受外界环境影响比较小,不仅重复性较好,而且结果比较准确。 |
申请公布号 |
CN103898076A |
申请公布日期 |
2014.07.02 |
申请号 |
CN201410061169.8 |
申请日期 |
2014.02.24 |
申请人 |
中国科学院武汉物理与数学研究所 |
发明人 |
董旭;唐淳 |
分类号 |
C12N9/10(2006.01)I;C12Q1/48(2006.01)I;G01N21/64(2006.01)I |
主分类号 |
C12N9/10(2006.01)I |
代理机构 |
北京捷诚信通专利事务所(普通合伙) 11221 |
代理人 |
魏殿绅;庞炳良 |
主权项 |
一种制备交联NAMPT及筛选NAMPT抑制剂的方法,其特征在于,包括以下步骤:S1、制备NAMPT重组蛋白;S2、按照摩尔份,将1份NAMPT重组蛋白加入20~100份还原剂中;在温度为20℃~25℃的条件下孵育0.5h~1.5h,得到粗蛋白;采用脱盐柱除去粗蛋白中的还原剂,得到预处理蛋白;S3、按照摩尔份,将1份预处理蛋白与2~5份1,4‑双(马来酰亚胺基)丁烷混合均匀,在温度为20℃~25℃的条件下静置反应1h~5h,采用脱盐柱除去未反应的1,4‑双(马来酰亚胺基)丁烷,得到交联NAMPT;S4、预置PBS缓冲溶液,将PBS缓冲溶液分为3份:第一PBS缓冲溶液、第二PBS缓冲溶液、第三PBS缓冲溶液,所述第一PBS缓冲溶液和第二PBS缓冲溶液的体积相同;向第一PBS缓冲溶液中加入NAMPT重组蛋白,形成浓度小于50μM的第一蛋白溶液;将第一蛋白溶液平均装入偶数支容积为500μL~2mL的第一石英管中,将所述第一石英管平均分为2组:A组、B组;向第二PBS缓冲溶液中加入交联NAMPT,配置浓度与第一蛋白溶液相同的第二蛋白溶液;将第二蛋白溶液平均装入偶数支容积为500μL~2mL的第二石英管中,每支第二石英管中的第二蛋白溶液的体积,与每支第一石英管中第一蛋白溶液的体积相等,将所述第二石英管平均分为两组:C组、D组;S5、配置浓度为0.5mM~1.5mM的待选择抑制剂溶液,向A组的每支第一石英管中加入体积不一的待选择抑制剂溶液,每支第一石英管中第一蛋白溶液的NAMPT重组蛋白的摩尔量:待选择抑制剂溶液的摩尔量为1:0~1:100;每支第一石英管加入待选择抑制剂溶液后混合均匀,在温度为20℃~25℃的条件下,静置5min~15min,得到第一待分析溶液;向B组的每支第一石英管中加入体积不一的第三PBS缓冲溶液,每支第一石英管中第三PBS缓冲溶液的体积,与A组对应的第一石英管中待选择抑制剂溶液的体积相同,每支第一石英管加入第三PBS缓冲溶液后混合均匀,在温度为20℃~25℃的条件下,静置5min~15min,得到第一对照溶液;向C组的每支第二石英管中加入体积不一的待选择溶液,每支第二石英管中待选择抑制剂溶液的体积,与A组对应的第一石英管中待选择抑制剂溶液的体积相同,混合均匀,每支第二石英管加入待选择抑制剂溶液后混合均匀后,在温度为20℃~25℃的条件下,静置5min~15min,得到第二待分析溶液;向D组的每支第二石英管中加入体积不一的第三PBS缓冲溶液,每支第二石英管中第三PBS缓冲溶液的体积,与A组对应的第一石英管中待选择抑制剂溶液的体积相同,每支第二石英管加入第三PBS缓冲溶液后,混合均匀,在温度为20℃~25℃的条件下,静置5min~15min,得到第二对照溶液;S6、使用荧光光谱仪测定第一待分析溶液的荧光强度、第一对照溶液的荧光强度、第二待分析溶液的荧光强度、第二对照溶液的荧光强度;S7、根据第一待分析溶液的荧光强度和第一对照溶液的荧光强度,计算第一待分析溶液荧光强度下降的百分率;根据第二待分析溶液的荧光强度和第二对照溶液的荧光强度,计算第二待分析溶液荧光强度下降的百分率。 |
地址 |
430000 湖北省武汉市武昌区小洪山西30号 |