一种预测转Bt基因棉花抗虫性强度的方法

摘要

本发明涉及一种预测转Bt基因棉花抗虫性强度的方法，属于生物技术领域。包括：棉籽浸种、取种胚，利用Cry1Ab/Ac的ELISA试剂盒进行Bt毒蛋白的提取，毒蛋白含量测定，采用测定的毒蛋白含量划分其抗性等级。本发明提供了一种抗虫棉抗性强度的早期预测方法，即通过检测棉种胚的毒蛋白含量水平来早期预测抗虫棉株未来整体抗虫性的强弱。该方法只需少量棉种，通过利用其种胚在室内检测其毒蛋白含量，即可对棉种的抗虫性进行快速评判，为提升转Bt基因抗虫棉的育种效率提供技术支持。

主权项

利用棉种胚预测转Bt基因棉花抗虫性的方法，包括：   1）棉种在25℃条件下浸种20‑28小时，取浸种后的种子20粒，用手按棉种，在珠孔端挤出完整种胚或剥出种胚；2）称取0.10‑0.15g种胚或数15个种胚，加0.25‑0.5ml Cry1Ab/Ac的ELISA 试剂盒样品提取液，用组织研磨器匀浆3min，转入1.5ml离心管，6000转/min，离心10 min，取上清液待检，残渣弃去；3）加标样及待测样：将Bt标样用样品稀释液配成 45、15、5、1.7 ng/ml；将系列标准样加入96孔的Cry1Ab/Ac的酶标板的前两列，每个浓度加2孔，每孔50μl；其余孔加待测样：按预试验结果，依次2倍做2个浓度稀释，保证各样品的OD值均在标准曲线范围内，每孔加样50μl；4）加抗体：用样品稀释液1:1000稀释Bt毒蛋白抗体，混匀后每孔加50μl，然后将酶标板加入湿盒内开始反应， 37℃条件下 90 min；5）洗板：将反应液甩干并在纸上拍净用洗板机洗涤四次；6）显色：在每孔中加100μl TMB，37℃ 15 min，每孔加入100μl盐酸终止反应；7）比色：在酶联免疫分光光度计上依次测定标准物各浓度和各样品450nm处的OD值；8）结果计算根据标准样品2次测定数据的平均值，绘制标准曲线；其中横坐标X为各浓度显色OD₄₅₀值表示，纵坐标Y为蛋白标样各浓度值ng/ml，拟合曲线得出标准方程；待测样品毒蛋白含量计算：根据标准曲线方程，从显色OD₄₅₀值，计算出被测样品的蛋白浓度ng/ml；而后乘稀释倍数，计算待测样品的平均毒蛋白含量ng/ml，最后依据公式：样品平均毒蛋白浓度ng/ml×样品原体积／样品胚重量，得样品每克种胚鲜重的毒蛋白含量ng/g；9）按毒蛋白划分抗性等级采用测定的毒蛋白含量划分其抗性等级，具体标准如下：不抗——Bt蛋白≤5ng/g鲜重; 低抗——5ng/g＜Bt蛋白≤150ng/g鲜重；中抗——150ng/g＜Bt蛋白≤300ng/g鲜重；中高抗——300ng/g＜Bt蛋白≤450ng/g鲜重；高抗——Bt蛋白＞450ng/g鲜重。