一种快速准确检测番茄黄化曲叶病毒的方法

摘要

本发明涉及基因工程中病毒检测技术领域一种快速准确检测番茄黄化曲叶病毒的方法：从病叶总DNA中克隆得到TYLCV-CP基因片段，与pET-32a连接转化受体菌，对阳性菌落诱导表达并纯化出目的蛋白；免疫家兔制备抗血清，对纯化的抗体进行碱性磷酸酶标记，使用DAS-ELISA方法对待检病株进行检测。本发明检测番茄黄化曲叶病毒的方法，其灵敏度高，可用于定性、定量分析，最低检测限为9.75ng/mL；操作简单快速，可在数小时内完成；特异性强，重复性好，针对番茄黄化曲叶病毒有非常明显的免疫学反应；可靠性高，其检出准确率与PCR法非常接近；检测成本低廉，试剂用量少并可以较长时间保存，非常适合大规模的常规检测。

主权项

一种快速准确检测番茄黄化曲叶病毒的方法，其特征是包括以下步骤：（1）从感染黄化曲叶病毒病的番茄病叶中提取总DNA，以此为模板通过PCR扩增获得TYLCV‑CP基因的特异性DNA片段，所用引物为：TYCP1：5’‑GCG GAATTCATGTCGAAGCGACCAGGCGAT‑3’， 下划线为EcoRI酶切位点，TYCP2：5’‑GCG CTCGAGATTTGATATTGAATCATAG‑3’， 下划线为Xho I酶切位点；（2）将TYLCV‑CP基因片段与表达载体pET‑32a连接，转化受体菌E.coliBL21(DE3)获得抗性菌落，筛选出阳性克隆，然后在含有0.1‑0.5 mmol/L异丙基‑β‑D‑硫代吡喃半乳糖苷的条件下进行诱导表达，离心收集菌体，菌体破碎后纯化目的蛋白；（3）以纯化的目的蛋白为抗原免疫家兔，效价为1:16000时采血收集抗血清，将抗血清纯化，获得纯度为95‑98%，浓度为20‑24.3mg/mL的抗体IgG；（4）用戊二醛一步法对纯化的抗体进行碱性磷酸酶标记，获得碱性磷酸酶标记抗体IgG‑AP，其中 IgG浓度为0.822‑1.145mg/mL；（5）以健康的幼苗为阴性对照，以感病幼苗为阳性对照，纯化的IgG包被后与碱性磷酸酶标记抗体IgG‑AP对待检样品进行DAS‑ELISA检测，最后加入PNPP配成的底物溶液进行显色；其中IgG包被浓度为6.25μg/mL，酶标抗体稀释度为1:400；IgG包被条件为4℃过夜，封闭时间为60min；酶标抗体作用时间为120min，底物显色条件为37℃条件下30min；底物溶液为将5mg对硝基苯磷酸二钠溶于7.5mL的含11.6%二乙醇胺的pH为9.8的底物缓冲液中。