主权项 |
一种快速检测大豆脂氧酶缺失的方法,其特征在于包括以下步骤:(1)大豆Lox脂氧酶蛋白的提取:取种子1粒,在其胚轴的相反侧,切取种子细粉6~8mg,放入1.5mL的离心管中,加入提取缓冲液,用震荡器搅拌均匀,超声波萃取6~8min,室温下放置20~30min,再度搅拌后,5000r·min<sup>‑1</sup>离心5min,取上清液10μL‑12μL用于SDS‑PAGE电泳解析;所述提取缓冲液为0.05mol·L<sup>‑1</sup>Tris‑HCl,pH7.2,内含体积分数为2%的巯基乙醇,溴酚蓝指示剂适量,加入量为1mL;(2)聚丙烯酰胺凝胶的制备:成胶溶液的配制:A液:配制成由4.0g/L SDS,3M Tris‑HCl组成的混合溶液,pH值调至8.8;B液:配制成0.48M HCl溶液,用Tris调整PH至7.0;C液:配制成由300g/L的丙烯酰胺,8g/L的双丙烯酰胺组成的混合溶液;P液:配制成15g/L的过硫酸铵溶液;E液:配制成0.04g/L的核黄素溶液;分离胶的配制:配制质量体积百分比为6.75%的聚丙烯酰胺凝胶液,以规格为16cm×14cm的玻璃板制取1mm厚的胶2枚,需分离胶溶液36mL,由以下体积的溶液组成:A液9.0mL、C液8.1mL、P液1.8mL、蒸馏水17.1mL、N,N,N',N'‑四甲基乙二胺24μL;浓缩胶配制:配制上述规格的胶,两块板需浓缩胶溶液12mL,由以下体积的溶液组成:B液3.2mL,C液2.0mL,E液2.6mL,P液0.4mL,蒸馏水3.8mL、N,N,N',N'‑四甲基乙二胺12μL;(3)SDS‑PAGE电泳:电泳缓冲液的配制:配制成甘氨酸14.4g/L,Tris3.0g/L,SDS1.25g/L的混合溶液,备用;(4)胶的染色及脱色。 |