借助于探测和标记的寡核苷酸切割以及延长试验的靶核酸序列检测

摘要

本发明涉及借助于探测和标记的寡核苷酸切割以及延长试验的靶核酸序列检测。本发明通过切割与靶核酸序列杂交的探测和标记寡核苷酸放出片段，并且，所述片段与捕捉和制模寡核苷酸杂交形成延长双链体后检测所述延长双链体的存在来检测靶核酸序列。延长双链体提供由表示延长双链体存在的标记发出的信号（信号的产生、增加、消灭或者减少），并具有可调节的Tm值，这能够很好地被适用于对靶核酸序列的存在的检测。

主权项

一种借助PTOCE（PTO切割以及延长）试验来从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤（a），将所述靶核酸序列与上游寡核苷酸以及PTO(探测和标记寡核苷酸)进行杂交；所述上游寡核苷酸包含与所述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；所述PTO包含：（i）3’‑靶向部位，其包含与所述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列，以及（ii）5’‑标记部位，其包含与所述靶核酸序列非‑互补的核苷酸序列；所述3’‑靶向部位与所述靶核酸序列杂交，所述5’‑标记部位则不与所述靶核酸序列杂交；所述上游寡核苷酸位于所述PTO的上游；步骤（b），在用于所述PTO的切割的条件下，将步骤（a）的结果物与具有5’核酸酶活性的酶相接触；所述上游寡核苷酸或者其延长链诱导借助于具有所述5’核酸酶活性的酶对所述PTO的切割，从而所述切割释放出包含所述PTO的所述5’‑标记部位或者所述5’‑标记部位的一部分的片段；步骤（c），将从所述PTO释放出的所述片段与CTO（捕捉和制模寡核苷酸）进行杂交；所述CTO沿着3’→5’方向包含：（i）捕捉部位，其包含与所述PTO的所述5’‑标记部位或者所述5’‑标记部位的一部分互补的核苷酸序列，以及（ii）制模部位，其包含与所述PTO的所述5’‑标记部位以及所述3’‑靶向部位非‑互补的核苷酸序列；从所述PTO释放出的所述片段与所述CTO的所述捕捉部位杂交；步骤（d），利用步骤（c）的结果物以及模板‑依赖性核酸聚合酶来实施延长反应；杂交于所述CTO的所述捕捉部位的所述片段被延长，形成延长双链体；所述延长双链体具有根据（i）所述片段的序列和/或长度、（ii）所述CTO的序列和/或长度、或者（iii）所述片段的序列和/或长度和所述CTO的序列和/或长度可进行调节的Tm值；所述延长双链体借助（i）与所述片段和/或CTO连接的至少一个标记、（ii）在所述延长反应期间插入到所述延长双链体内的标记、（iii）与所述片段和/或所述CTO连接的至少一个标记和在所述延长反应期间插入到所述延长双链体内的标记、或者（iv）嵌入标记来提供靶信号；以及步骤（e），在所述延长双链体维持其双链形态的指定温度下，通过测定所述靶信号来检测所述延长双链体，由此，所述延长双链体的存在表示所述靶核酸序列的存在。