一种产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗及其应用

摘要

本发明涉及一种产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗及其应用；先设计特异性引物，对A型产气荚膜梭菌DNA进行PCR扩增获得α毒素基因片段克隆到pMD18-T Vector载体后，选取阳性重组子，连接到PET-28a（+）质粒上，将重组质粒导入受体菌株，成功构建重组菌株BL21(DE3)-α。将制取好的α毒素蛋白与氢氧化铝佐剂以体积比为9：1的比例进行乳化，加入0.01%的硫柳汞，即得产气荚膜梭菌α毒素基因工程苗，易于工业化生产，操作简单，安全性好，产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗能有效预防因A型产气荚膜梭菌引起的动物坏死性肠炎、肠毒血症、人畜创伤性气性坏疽等疾病。

主权项

一种产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗，其特征在于产气荚膜梭菌α毒素蛋白与氢氧化铝佐剂以体积比为9：1的比例进行乳化，每100ml乳化液中加入0.01克硫柳汞得到；所述的产气荚膜梭菌α毒素蛋白的制备步骤如下：1）设计引物根据Genebank上已经提交的α毒素基因序列扩增α毒素特异性基因片段，设计引物：primer1和primer2,并分别加入Nco I和BamH I酶切位点；primer1：5'‑ATGAAAAGAAAGATTTGTAAGGCG‑3'            Nco Iprimer2：5'‑TTATTTTATATTATAAGTTGAATTTCCTGAAATCC‑3' BamH I2）制备模板和PCR扩增目的基因用接种环挑取A型产气荚膜梭菌菌种，接种于一个血平板培养基上，37℃厌氧培养36h；取单个菌落接种于一个含7‑8毫升硫乙醇酸盐流体培养基的试管内，37℃厌氧培养12h，培养菌液提取DNA模板；PCR扩增目的基因，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，回收扩增产物；3）将α毒素目的DNA克隆到pMD18‑T Vector载体将步骤2）中回收的扩增产物克隆到pMD18‑T Vector，将克隆产物与Top10感受态细胞混合后进行转化，筛选重组转化菌提取质粒pMD18‑T‑α；经酶切测序确定阳性重组质粒pMD18‑T‑α；4）构建原核表达载体pET28a‑α将阳性重组质粒pMD18‑T‑α与表达载体pet28a双酶切，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳,回收目的条带和pet28a线性载体；将回收产物与pet28a线性载体连接，构建原核表达载体pET28a‑α；将pET28a‑α与BL21(DE3)pLysS感受态细胞混合后进行转化，得到重组菌株BL21(DE3)‑α；5）α毒素蛋白的诱导表达、纯化用0.1mM的IPTG，37℃，对重组菌诱导表达12h，经纯化得到α毒素蛋白。