丛枝菌根真菌地表球囊霉菌剂的温室扩繁方法

摘要

本发明涉及一种丛枝菌根真菌地表球囊霉菌剂的温室扩繁方法，该方法包括以下步骤：⑴分离筛选地表球囊霉的孢子；⑵将种子A、培养容器A及温室、苗床消毒；⑶制备地表球囊霉菌剂：①在消毒后的种子A上滴加地表球囊霉的孢子后加盖玻璃珠进行培养，收获玻璃珠和植物根系；②玻璃珠和植物根系加水搅拌混匀后过滤，得到新生孢子；③将所有孢子进行二次鉴定，该培养出来的地表球囊霉孢子作为地表球囊霉菌剂；⑷配制灭菌基质；⑸将种子B、培养容器B及温室、苗床消毒；⑹在灭菌基质上平铺地表球囊霉孢子后覆灭菌基质，再播种消毒后的种子B进行栽培，即得扩繁的菌剂；⑺对扩繁的菌剂测定AM真菌孢子密度，确定扩繁的菌剂质量。本发明高效、经济、环保。

主权项

1.丛枝菌根真菌地表球囊霉菌剂的温室扩繁方法，包括以下步骤：⑴分离筛选地表球囊霉的孢子：在甘肃省庆阳市西峰区E107^o51’、N35^o39’的黄土高原沟壑区采集野生柠条锦鸡儿根际0~30cm深度的根际土壤，置于阴凉处自然风干；然后采用湿筛倾注法从所述根际土壤中分离得到地表球囊霉的孢子；其次，在解剖镜下采用解剖针将孢子和孢子果挑到洁净的培养皿A中，在体视显微镜下观察，根据孢子的形状、大小、颜色、表面修饰、孢子壁的层次及染色反应、孢子内含物，连孢菌丝、孢子囊、辅助细胞的有无对所有孢子进行分类，确定其种属、并分类存放；最后，根据常规地表球囊霉孢子的特征、特性判断分离得到地表球囊霉的孢子，并用解剖针将所述地表球囊霉的孢子单独挑出至一个培养皿B中；⑵选择品种为中穗蛇眼的高粱作为宿主植物；将饱满、均一、健康的所述高粱种子采用体积浓度为0.1%的次氯酸钠溶液消毒2min，然后用蒸馏水清洗干净，得到消毒后的种子A；同时，采用巴氏消毒液将直径为8cm、高5cm的塑料花盆消毒后作为培养容器A；并在培养前一星期，采用巴氏消毒液对温室、苗床进行消毒；⑶制备地表球囊霉菌剂：①在所述培养容器A中装经清洗干净的玻璃珠0.5kg，在每个所述培养容器A中播种1粒所述消毒后的种子A，采用吸管在解剖镜下从所述培养皿B中吸取一个所述步骤⑴所得的地表球囊霉的孢子，并将其滴加在所述消毒后的种子A上；之后在该消毒后的种子A上加盖0.5cm厚的玻璃珠，在白天温度为25±2℃或夜间温度为19±2℃、相对湿度为65±5%、光照强度为800~1100μmolm²s¹、光照周期保持在白天为14h或夜晚为10h的条件下进行培养，每隔15天分别给每个所述培养容器A中的植株浇施20mL去P的Hoagland营养液；同时，每隔一天浇蒸馏水一次；最后在培养15周后进行收获，剪去所述培养容器A中的地上部分生物体，收获所述培养容器A内的玻璃珠和植物根系；②将所述培养容器A内所有的玻璃珠和植物根系置于2000mL的烧杯中，加1000~1200mL水，经搅拌、充分混匀后采用上层孔径为0.355mm、下层孔径为0.05mm的两层筛网进行过滤，所述玻璃珠和植物根系留在所述上层筛网之中，由所述地表球囊霉单孢子培养获得的新生孢子将留在所述下层筛网中；③将所述下层筛网中的所有孢子转移至培养皿C中，在解剖镜下采用解剖针将所述孢子挑到洁净的培养皿D中，在体视显微镜下观察，根据孢子的形状、大小、颜色、表面饰纹、孢子壁的层次及染色反应、孢子内含物，连孢菌丝、孢子囊、辅助细胞的有无，根据常规地表球囊霉孢子的特征、特性对培养出来的孢子进行二次鉴定，确认单孢子培养的丛枝菌根真菌为地表球囊霉，并将该单孢子培养出来的地表球囊霉孢子作为地表球囊霉菌剂；⑷配制灭菌基质：将河沙与黄绵土按3L：1L的比例混合后，使其pH值为6.37~8.09，速效氮为56.8~83.7mg/kg，速效磷为6.15~11.45mg/kg，速效钾为76.4~132.5mg/kg，有机质为26.7~39.6g/kg；然后在温度为160℃的条件下进行干热灭菌4h，即得灭菌基质；⑸选择品种为中穗蛇眼的高粱或品种为九单2号的玉米作为宿主植物；将饱满、均一、健康的所述高粱种子或玉米种子采用体积浓度为0.1%的次氯酸钠溶液消毒2min，然后用蒸馏水清洗干净，得到消毒后的种子B；同时，采用巴氏消毒液将直径为21cm、高16cm的塑料花盆消毒后作为培养容器B；并在培养前一星期，采用巴氏消毒液对温室、苗床进行消毒；⑹在每个所述培养容器B中先装所述灭菌基质4.5kg，然后将100个所述步骤⑶所得的地表球囊霉孢子作为接种剂平铺其上，再覆盖1kg的所述灭菌基质，其次，在每个所述培养容器B中分别播种5粒所述消毒后的种子B，在白天温度为25±2℃或夜间温度为19±2℃、相对湿度为65±5%、光照强度为800~1100μmolm²s¹、光照周期保持在白天为14h或夜晚为10h的条件下进行栽培，40d和80d分别给每个所述培养容器B浇施100mL去P的Hoagland营养液；最后在培养15周后进行收获，剪去所述培养容器B中的地上部分生物体，保留所述培养容器B内的土壤基质和植物根系，该所述培养容器B内所有的土壤基质和植物根系取出后置于阴凉、干燥处自然风干，混匀后即得到扩繁的菌剂；⑺称取20g所述扩繁的菌剂，采用湿筛倾注法测定AM真菌孢子密度，确定扩繁获得的菌剂质量；当每1g扩繁菌剂内含≥50个健康有活力的孢子，即判为菌剂扩繁合格。