卵转铁蛋白的分离提取的方法

摘要

本发明公开了一种卵转铁蛋白的分离提取的方法，而提供一种产品的纯度高，方法简单，能够实现工业化生产的分离提取方法。将无粘蛋白蛋清溶液的pH值调节至7.5-9.0，采用乙醇析出法提取得到卵转铁蛋白粗品；利用两步弱酸性阳离子交换树脂层析法纯化上述卵转铁蛋白粗品，纯化的卵转铁蛋白在1-10℃条件下经透析除盐得到高纯度的卵转铁蛋白。本发明的方法利用醇析法结合弱酸性阳离子交换法提取分离卵转铁蛋白，先让卵转铁蛋白在碱性条件下生成复合物，然后再通过醇析法提取分离得到卵转铁蛋白粗品，再利用两步弱酸性阳离子交换树脂层析法纯化，所得产品的纯度高，提高了卵转铁蛋白制备的规模和产量，方法简单，有利于实现产业化生产。

主权项

一种卵转铁蛋白的分离提取的方法，其特征在于，包括下述步骤：（1）将无粘蛋白蛋清溶液的pH值调节至7.5‑9.0，使卵转铁蛋白在碱性条件下生成三元复合物，采用乙醇析出法提取得到卵转铁蛋白粗品；（2）利用两步弱酸性阳离子交换层析法纯化上述卵转铁蛋白粗品，纯化的卵转铁蛋白在1‑10℃条件下经透析除盐得到高纯度的卵转铁蛋白；所述无粘蛋白蛋清溶液通过下述方法制备：将新鲜蛋清中加入三倍体积的去离子水或pH值为5.0‑6.0缓冲液稀释，过滤除去不溶性物质，并调节所得滤液的pH值至5.0‑6.0，在1‑10℃低速搅拌过夜，然后在1‑10℃、2500‑5000×g离心5‑20min，除去蛋清溶液中的粘性蛋白，便于以后的操作，离心获取的上清液即为无粘蛋白蛋清溶液；所述乙醇析出法提取卵转铁蛋白粗品的步骤如下：a、将pH值为7.5‑9.0的无粘蛋白蛋清溶液中加入NaHCO₃、NaCl和FeCl₃至NaHCO₃、NaCl和FeCl₃的终浓度分别为40‑70mmol/L、100‑250mmol/L和15‑30mmol/L，低速搅拌20‑40min后，蛋清溶液呈橙红色；b、之后，加入乙醇至乙醇终浓度为40‑45%v/v，并在1‑25℃下静置20‑40min，然后在1‑10℃、2500‑5000×g条件下离心10‑30min，使得蛋清中除卵转铁蛋白的其它蛋白沉淀；c、取上清液，并用40‑45%v/v乙醇将沉淀洗涤1‑2次，每次洗涤后离心取上清液；d、将上述多次离心所得上清液合并，继续加入乙醇至乙醇的终浓度为55‑60%v/v；e、在1‑25℃下低速搅拌15‑40min后，在1‑10℃、2500‑4500×g条件下离心10‑35min；f、取离心所得沉淀复溶于20‑50mmol/L的柠檬酸缓冲液中，并调节pH值至3.0‑5.0，加入已处理的pH值为4.7的阴离子交换树脂，在室温下低速搅拌3h，过滤去除吸附HCO^3‑的阴离子交换树脂，所得滤液经冻干后得到脱辅基‑卵转铁蛋白粗品;所述的利用两步弱酸性阳离子交换层析法纯化卵转铁蛋白粗品的步骤如下：g、将卵转铁蛋白粗品中加入pH值为7.5‑9.0、20‑40mmol/L的磷酸缓冲液溶解，至卵转铁蛋白的终浓度为50‑100mg/mL，得到卵转铁蛋白粗品溶液，并用NaOH溶液调节卵转铁蛋白粗品溶液的pH值至7.5‑9.0，之后，在1‑10℃、4000‑6000×g条件下离心20‑40min，取上清液；h、将上述上清液在pH值为7.5‑9.0操作范围内，用Na型弱酸性阳离子交换树脂层析去除碱性蛋白，收集层析法得到的峰1组分；i、用pH值为5.0‑5.6的H型弱酸性阳离子交换树脂层析收集峰2组分，峰2组分在4℃或6℃条件下经去离子水透析24h除盐得到高纯度的卵转铁蛋白；步骤h中所用层析柱的平衡缓冲液为pH值为7.5‑9.0、浓度为10‑30mmol/L的磷酸缓冲液；层析洗脱液为含有NaCl、pH值为7.5‑9.0、浓度为10‑30mmol/L的磷酸缓冲液，其中，所述NaCl的浓度为0.3‑1.0mol/L；流速为10‑25mL/min；步骤i中所用层析柱平衡缓冲液为pH值为5.0‑5.6、浓度为10‑20mmol/L的柠檬酸缓冲液；层析洗脱液为含有NaCl、pH值为5.0‑5.6、浓度为10‑20mmol/L的柠檬酸缓冲液，其中，所述NaCl的浓度为0.3‑1.0mol/L；流速为10‑25mL/min。