基因启动子区转录因子结合位点的多通量筛选方法

摘要

本发明公开了一种基因启动子区转录因子结合位点的多通量筛选方法，本发明设计了1对引物用于扩增MYOD1基因5′调控区的启动子区片段，将胶回收产物用T-载体PCR产物克隆试剂盒构建含有目的片段的重组质粒，然后利用Promoter-BindingTFProfilingAssayI和NuclearExtractionKit（CatalogNumberSK-0001）进行MYOD1基因启动子区转录因子结合位点的筛选，便于对牛MYOD1基因启动子的调控方式及调控元件进行研究。本发明的方法具有灵敏度高、检测速度快、操作简单、同时筛选多种转录因子、不需使用放射性同位素等优点。

主权项

一种基因启动子区转录因子结合位点的多通量筛选方法,其特征在于：包括以下步骤：步骤1）进行目的片段的克隆，构建含有目的片段的T载体：根据NCBI上牛MYOD1基因的序列进行启动子的生物信息学分析，找到该基因的转录起始位点，并预测其启动子区；然后根据5′调控区序列设计1对两端引物，以基因组DNA为模板，利用PCR反应进行扩增，获得目的片段；对目的片段进行胶回收纯化；再将纯化的目的片段与pUCm‑T载体连接过夜；过夜后将连接体系转化DH5α感受态细胞，然后进行铺板培养过夜；步骤2）重组质粒的鉴定：挑取上述平板上的白斑单菌落进行摇菌培养过夜，然后提取质粒进行pcr，将pcr产物送出测序；将测序结果与NCBI上的序列进行比对，利用测序正确的质粒为模版进行目的片段的大量扩增，然后进行胶回收并纯化；将测序正确的质粒菌液加甘油后‑80℃保存；步骤3：目的片段的浓缩：将上述回收纯化的目的片段混到一起，然后加2倍目的片段总体积的无水乙醇、与目的片段总体积相等的异丙醇，以及浓度为3mol/l的目的片段总体积的1/10的醋酸钠，然后混匀沉淀30分钟之后，在转速为12000‑15000rpm/min的条件下，离心3‑5min，去除上清液；加质量百分比为75%的乙醇1ml，用这些乙醇冲洗管壁直至混匀，然后在转速为12000‑15000rpm/min的条件下，离心3‑5min，去除上清液；重复一次，然后将管子倒扣在纸上晾干，直至无乙醇味；用ddH₂O溶解，并冲洗管壁振荡混匀，测其浓度；步骤4）细胞核提取物的提取：利用Nuclear Extraction Kit试剂盒提取牛肌肉组织的细胞核提取物，并利用BCA蛋白定量试剂盒对所提的细胞核提取物进行浓度测定；步骤5）牛MYOD1基因启动子区转录因子结合位点的预测：利用 Promoter‑Binding TF Profiling Assay I所提的细胞核提取物和回收纯化后浓缩的目的片段进行牛MYOD1基因启动子区的转录因子结合位点的筛选实验，实验结束后，对实验结果进行分析处理，即完成了基因启动子区转录因子结合位点的多通量筛选。