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一种玉米青枯病原镰刀菌对玉米苗期致病性的检测方法，其特征在于，所述的检测方法为：步骤一、水‑琼脂混合培养基的制备1）在1000mL水中加入17g琼脂，加热使琼脂溶解，后加入1.5g的硝酸钙、1.5g的硝酸钾、1g的磷酸二氢铵和0.5g的硫酸镁，搅拌均匀，形成混合液，分装于300mL三角瓶中，每瓶100mL，丙烯膜封口，并留有排气孔，然后将每一个含有混合液的三角瓶送入高压灭菌锅内，在压强为0.14MPa，温度为121℃，灭菌30分钟，制得营养琼脂培养基，备用；2）在无菌条件下，将步骤1）中每一个灭菌后的营养琼脂培养基中加入100mL的去离子水，然后将营养琼脂培养基搅碎至粒径为0.5‑‑0.8cm的颗粒时止，混合均匀，形成水‑琼脂混合培养基，备用；步骤二、玉米苗培养按重量份数取1份粒径为0.8mm的玉米和2份浓度为0.1%的汞，将玉米在汞中浸泡10分钟，取出，用去离子水洗涤3次，然后将洗涤后的玉米放到底层铺有无菌滤纸的培养容器中，后在培养容器内加入无菌去离子水，去离子水的加入量淹没滤纸时止，后将培养容器送入25℃的培养箱内，培养3‑4天待玉米发芽后，将玉米芽移植到水‑琼脂混合培养基中，25℃‑30℃条件下，见光培养，备用；步骤三、镰刀菌接种菌液制备与接种1）在100mL的去离子水中加入20g的马铃薯片，煮20‑30分钟，过滤，得到滤液，后在滤液中加入2g的葡萄糖，混合均匀，然后用去离子水定容至100mL止，制得马铃薯液体培养基，备用；2）在无菌条件下，在马铃薯液体培养基中接入一个玉米青枯病原镰刀菌种，送入摇床上，在25℃条件下，发酵培养4‑6天，形成玉米青枯病原镰刀菌培养菌液，然后在玉米青枯病原镰刀菌培养菌液中加入磁力搅拌器，转速为150转/分钟，搅拌160‑200分钟，使整个菌液呈糊状并能用玻璃吸管定量吸入状态，后继续培养24小时，形成镰刀菌接种菌液，备用；3）玉米幼苗生长至丙烯膜处，在丙烯膜上开一个玉米生长口，待玉米生长至4‑5片叶子时止，在无菌条件下，向培养玉米的三角瓶内加入5‑6mL步骤2）中得到的镰刀菌接种菌液，25‑30℃条件下，见光培养10天，得到感染玉米青枯病原镰刀菌的玉米，备用；步骤四、对感染玉米青枯病原镰刀菌的玉米进行检测1）取直径为2cm的感染玉米青枯病原镰刀菌玉米的根部及茎部，洗净，然后在研钵内加入1g感染玉米青枯病原镰刀菌玉米的根部及茎部、0.5mL的TE溶液、0.5mL的SDS溶液和2g的石英砂，研磨均匀，得到物料，备用；2）将步骤1）中得到的物料全部转入5mL离心管内，在65℃条件下放置10分钟，后加入600μL浓度为7.5mol/L的乙酸铵溶液，置于0℃条件下，放置8分钟，取出，将含有物料的5mL离心管送入离心机内，以转速为12000转/分钟，离心5分钟，得到上清液Ⅰ，在1.5mL离心管a内加入500μL的上清液Ⅰ、50μL浓度为3mol/L的NaAc和300μL的异丙醇，混合均匀，形成混合液Ⅰ，将含有混合液Ⅰ的1.5mL离心管a置于0℃条件下，放置8分钟，取出，后将含有混合液Ⅰ的1.5mL离心管a送入离心机内，以转速为13000转/分钟，离心10分钟，得到1.5mL离心管a底部的沉淀，备用；3）在含有沉淀的1.5mL离心管a内加入200μL的TE溶液，将沉淀溶解，后加入5μL的RNase酶，混合均匀，后置于65℃条件下，放置10分钟，再加入200μL的氯仿‑异戊醇混合液，混合均匀，形成混合液Ⅱ，将含有形成混合液Ⅱ的1.5mL离心管a送入离心机内，以转速为12000转/分钟，离心5分钟，得到上清液，在1.5mL离心管b中加入500μL的上清液Ⅱ、50μL浓度为3mol/L的NaAc和300μL的异丙醇，混合均匀，形成混合液Ⅲ，将含有混合液Ⅲ的1.5mL离心管b送入离心机内，以转速为12000转/分钟，离心10分钟，得到沉淀，备用；4）用浓度为70%的乙醇对步骤3）中1.5mL离心管b内的沉淀洗涤1次，待乙醇挥发完毕后，在1.5mL离心管b内加入25μL的TE溶液，混合均匀，形成DNA模板，备用；5）真菌ITS通用引物上游引物：5ˊ‑TCCGTAGGTGAACCTGCGG‑3ˊ下游引物：5ˊ‑TCCTCCGCTTATTGATATGC‑3ˊ6）在0.5ml离心管Ⅰ内加入2μL步骤4）中得到的DNA模板、4.0μL的10倍缓冲液、1μL的dNTP、1μL的上游引物、1μL的下游引物、1μL的Taq聚合酶和40.0μL的去离子水，混合均匀，得到混合液Ⅳ，备用；7）将含有混合液Ⅳ的0.5ml离心管Ⅰ放入基因扩增仪中，进行PCR扩增，PCR扩增程序为：94℃预变性5分钟，94℃变性45秒，55℃退火45秒，72℃延伸100秒，变性、退火和延伸为一次循环，共35次循环，后72℃再次延伸10分钟，取出，得到扩增产物，备用；8）利用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，在凝胶成像系统中确认扩增产物中含有551bp的目的条带，备用；9）用DNA凝胶回收试剂盒对扩增产物进行回收、纯化取1.5ml离心管c并称其重量，在紫外灯下将扩增产物从步骤8）中的凝胶上切下，将切下的扩增产物放在已称重的1.5ml离心管c中，称取1.5ml离心管c的总重并计算出从凝胶上切下来的扩增产物的重量，然后将1.5ml离心管c中的扩增产物捣碎，按扩增产物的克数加入相同毫升数的DNA纯化结合液，混合均匀，将1.5ml离心管c放置在50ºC水浴中加热至扩增产物完全融解，得到混合液Ⅴ，将混合液Ⅴ加到DNA纯化柱上，DNA纯化柱位于收集管中，收集管在21℃条件下放置1分钟，将收集管放入离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟后，取出含有沉淀物的DNA纯化柱<b>，</b>倒掉收集管内的液体，向DNA纯化柱上加入700微升的洗涤液，将DNA纯化柱置于收集管内，后将收集管在21℃条件下放置1分钟，后将收集管放入离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟后，取出含有沉淀物的DNA纯化柱<b>，</b>倒掉收集管内的液体，向DNA纯化柱上加入500微升的洗涤液，将DNA纯化柱置于收集管内，放入离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟后，取出含有沉淀物的DNA纯化柱<b>，</b>倒掉收集管内的液体，将DNA纯化柱置于收集管内，然后将收集管放入离心机内，转速13000转/分钟，离心1分钟，取出DNA纯化柱放置于1.5ml离心管d中，后在DNA纯化柱上加入40微升洗脱液，将1.5ml离心管d在21℃条件下放置1分钟，然后将收集管放入离心机内转速13000转/分钟，离心1分钟，取出DNA纯化柱得到1.5ml离心管中d中的液体，备用；10）将步骤9）中回收、纯化后的液体进行测序，并在Genbank进行比对，确定为玉米青枯病原镰刀菌，即玉米上感染玉米青枯病原镰刀菌；所述的DNA纯化结合液的组成成份：每升DNA纯化结合液中含有25mmol的葡萄糖、10mmol的三羟甲基氨基甲烷‑盐酸、5mmol的乙二胺四乙酸，余量为水；所述的洗涤液的组成成份：按重量百分比洗涤液中含有8%的十二烷基磺酸钠，余量为水；所述的洗脱液的组成成份：每升洗脱液中含50mmol的三羟甲基氨基甲烷、10mmol的乙二胺四乙酸，余量为水；所述的SDS溶液的组成成份：每升SDS溶液中含有50mmol的三羟甲基氨基甲烷和10g的十二烷基硫酸钠，余量为水；所述的氯仿‑异戊醇混合液的组成成分：按体积比氯仿‑异戊醇混合液中含有24份的氯仿和1份的戊醇；所述的TE溶液的组成成份：每升TE溶液中含有10mmol的三羟甲基氨基甲烷‑盐酸、1mmol的乙二胺四乙酸，余量为水。 |
