小鼠裸卵体外成熟方法及小鼠裸卵体外成熟培养液

摘要

本发明公开了小鼠裸卵体外成熟方法及小鼠裸卵体外成熟培养液。其中，小鼠裸卵体外成熟方法的步骤包括（1）小鼠裸卵的分离培养；（2）小鼠裸卵的成熟检测；（3）小鼠裸卵成熟后发育能力检测。小鼠裸卵体外成熟培养液由α-MEM+10%FBS+10ng/ml EGF+1.5U/ml hCG+1mM/ml Glu+0.23mM/ml丙酮酸钠+10uM Forskolin组成。本发明通过在小鼠卵母细胞培养体系中添加同卵母细胞体外成熟相关的化学试剂，建立了小鼠裸卵体外高效成熟发育体系，该体系不仅能够有效人工调控小鼠裸卵的体外成熟，而且成熟后的裸卵能够具有正常卵母细胞形成胚胎的发育能力，从而为小鼠作为实验动物模型在新品种培育、转基因育种和品种改良等方面的重要的材料，也为人类辅助生殖技术的纵深发展提供基础。

主权项

小鼠裸卵体外成熟方法，包括以下步骤：（1）小鼠裸卵的分离培养实验动物为性成熟后小鼠，采用颈部脱臼处死小鼠，取出卵巢组织，清洗血迹，分离除去多余的脂肪组织，将卵巢放置在裸卵洗涤培养液中，体视显微镜下，用分离针轻轻划破卵巢表面有腔卵泡，处于不同发育状态的裸卵进入到裸卵洗涤培养液中，收集裸卵洗涤后随机分组，用裸卵体外成熟培养液进行37℃培养；所述裸卵洗涤培养液为 α‑MEM + 10% FBS；（2）小鼠裸卵的成熟检测小鼠裸卵体外成熟培养24小时后，在显微镜下观察记录培养成熟裸卵排出第一极体情况，并且要求裸卵形态正常，裸卵胞质颜色光泽均一；成熟培养后小鼠裸卵用多聚甲醛固定液固定，经磷酸盐缓冲液洗涤，TrionX‑100细胞膜通透，含牛血清白蛋白磷酸盐缓冲液封闭，通过免疫细胞组织化学方法，用抗微管蛋白的单克隆抗体监测成熟裸卵纺锤体的微管蛋白发育状态，裸卵内细胞核遗传物质DNA分裂分离形成第一极体的状况，用细胞核遗传物质DNA特异性染料DAPI染色显示；（3）小鼠裸卵成熟后发育能力检测将成熟后的裸卵用裸卵体外成熟培养液洗涤后，用在含乙醇的裸卵体外成熟培养液中孵育，经胚胎培养液KSOM洗涤后，转移到胚胎培养液KSOM微滴中进行培养；所述裸卵体外成熟培养液为 α‑MEM + 10% FBS + 10ng/ml EGF + 1.5U/ml hCG + 1 mM/ml Glu + 0.23 mM/ml丙酮酸钠 + 10 uM Forskolin。