一种成熟人β防御素-2及其制备方法

摘要

本发明公开了一种成熟人β防御素-2及其制备方法，该方法是将谷氨酸残基引入人β防御素-2的成熟序列和前肽之间，通过重组表达得到人β防御素-2前原肽，经镍柱亲和层析纯化得到较高纯度的人β防御素-2前原肽，然后用带His-tag的重组地衣芽孢杆菌谷氨酸特异性内肽酶进行酶解处理，将前肽及亲和标签切除，并再次通过亲和层析去除重组地衣芽孢杆菌谷氨酸特异性内肽酶和其他杂质，纯度较高的成熟人β防御素-2存在于穿过液中。本发明所述的成熟HBD-2制备方法具有高效、安全无毒性、成本低和纯化工艺简单的优点，从而为成熟HBD-2的大规模制备及其应用奠定基础。

主权项

一种成熟人β防御素‑2的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）人β防御素‑2前原肽重组表达载体的制备a.以SEQ ID NO:1‑2的核苷酸序列为上、下游引物，以HBD‑2前原肽序列为模板，进行PCR扩增，获得重组HBD‑2前原肽目的基因序列，在其N端融合His₆标签，在其C端引入终止子；所述模板的核苷酸序列为SEQ ID NO:3；b.步骤a所得产物用NdeI和XhoI进行双酶切，然后与NdeI和XhoI双酶切的表达载体pET22b连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；c.从步骤b中感受态细胞中提取质粒进行双酶切及测序鉴定，所得阳性克隆转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中进行表达，得到HBD‑2重组表达载体；（2）重组HBD‑2前原肽的制备a.工程菌诱导表达将步骤（1）所得HBD‑2重组表达载体接种于含氨苄青霉素的液体LB培养基中，于37℃振摇过夜，然后按1：50的体积比接种于含有氨苄青霉素的液体LB培养基中，于OD=0.4‑0.8时加入IPTG至终浓度为0.8mM，继续培养4h后收集菌液，离心，去除上清液，细菌沉淀用TE缓冲液洗涤2次后，用细菌裂解液重悬，于冰浴下超声，取超声后的匀浆物离心，收集上清液；b.表达产物的纯化取步骤a收集的上清液，以Ni²⁺‑NTA树脂亲和层析法进行纯化，即得到重组HBD‑2前原肽；（3）成熟HBD‑2的制备a.重组HBD‑2前原肽的酶处理取步骤（2）所得重组HBD‑2前原肽，在20mM、pH8.5的Tris‑HCl中透析12h，加入1%w/w的重组地衣芽孢杆菌谷氨酸特异性内肽酶，于37℃处理1h后立即置于0℃冰浴中以终止反应；b.成熟HBD‑2的获得将步骤a酶处理过的HBD‑2前原肽酶解液上样至Ni²⁺‑NTA树脂亲和层析柱，收集穿过液，成熟的HBD‑2即存在于所得穿过液中。