果糖赖氨酸酶的制备方法及其应用

摘要

本发明提供一种果糖赖氨酸酶的制备方法以及用该方法制备所得的果糖赖氨酸酶进行制备的糖化白蛋白检测试剂盒。该方法包括以下操作步骤：筛选菌株，获得高活性果糖赖氨酸酶的曲霉菌株11-82；培养11-82曲霉菌株，收集菌丝；将菌丝悬浮于缓冲液中，经细胞破碎、离心，收集上清液；使用硫酸铵溶液对上清液进行分级沉淀，收集沉淀，得到粗提液；将粗提液进行疏水层析，收集洗脱液；将收集的洗脱液进行亲和层析，收集洗脱液，即得果糖赖氨酸酶溶液。该方法制备步骤简单，且得到的果糖赖氨酸酶纯度高、活性高、反应特异性高。

主权项

一种果糖赖氨酸酶的制备方法，其特征在于包括以下操作步骤： （1）培养：用培养基培养11‑82曲霉菌株，收集菌丝并清洗； （2）初提：取已清洗的菌丝悬浮于缓冲液中，经细胞破碎、离心，收集上清液；菌丝与缓冲液的重量体积比为1︰3～5； （3）硫酸铵沉淀：使用硫酸铵溶液对步骤（2）所得上清液进行分级沉淀，将最后收集得到的沉淀溶于buffer A中，得到粗提液； （4）疏水层析：用buffer A平衡疏水层析柱，再将步骤（3）得到的粗提液上样吸附，吸附结束后，用硫酸铵溶液进行梯度洗脱，收集洗脱液； （5）亲和层析：将除果糖赖氨酸以外的果糖氨基酸偶联到固相化载体上，用buffer A平衡层析柱后，将经疏水层析柱洗脱后的洗脱液上样，进行亲和吸附，吸附后，用硫酸铵溶液进行梯度洗脱，收集洗脱液，即得果糖赖氨酸酶溶液； 其中：buffer A为以5～15mM、pH8～8.5的Tris‑Hcl缓冲液作为底液进行配制的15%～30%的饱和硫酸铵； 所述步骤（1）中11‑82曲霉菌株为自行筛选的菌种，分类命名为黑曲霉，拉丁文学名为Aspergillus niger，于2011年10月21日在北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.5364； 所述步骤（1）中培养基的成分包括果糖赖氨酸5～10g/L、葡萄糖5～15g/L、磷酸氢二钾0.5～1.5g/L、磷酸二氢钠0.5～1.5g/L、硫酸镁0.2～0.8g/L、氯化钙0.05～0.2g/L、维生素混合溶液0.5～2‰、金属离子混合溶液0.5～2‰，培养基的pH为4.5～6.5，其中维生素混合溶液的成分包括V_B1·Hcl0.5～1.5g/dL、核黄素1.5～2.5mg/dL、泛酸钙1～3mg/dL、V _B6·Hcl1～3mg/dL、生物素0.05～0.2mg/dL、氨基苯甲酸0.5～2mg/dL、烟碱酸1～3mg/dL、叶酸0.05～0.15mg/dL，金属离子混合溶液的成分包括硫酸镁1～3g/L、硫酸锌1.5～3g/L、硫酸铜0.1～1g/L、氯化钴0.1～0.5g/L、钼酸钠0.2～0.3g/L、硼酸0.2～0.6g/L、碘化钾0.01～0.15g/L； 所述步骤（2）中缓冲液为磷酸缓冲液或Tris‑Hcl缓冲液； 所述步骤（5）中固相化载体为NHS‑activated Sepharose 4 fast Flow或CNBr‑activated Sepharose 4 fast Flow。