一种包含L-丙氨酸消旋酶基因的基因工程菌及其应用

摘要

本发明公开了一种包含L-丙氨酸消旋酶基因的基因工程菌及其应用。该菌株包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。本发明的基因工程菌可以通过消旋L-丙氨酸生产DL-丙氨酸，且用量少、反应时间短、可以多批次重复利用，通过本发明的基因工程菌，消旋过程的转化率达到99.0％以上，产品纯度达到99.5％以上，具有良好的产业化前景。

主权项

一种基因工程菌在制备DL‑丙氨酸中的应用； 其中，所述的基因工程菌包含如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列； 所述的基因工程菌由如下步骤构建得到： (1)构建含有L‑丙氨酸消旋酶基因的表达载体： 提取发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum CGMCC2921的基因组DNA作为模板，以包含EcoRI和NotI酶切位点的下列核苷酸序列作为引物，进行PCR扩增： 引物1：5’‑GGAATTCATGGTAAGTGCAC‑3’； 引物2：5’‑AAGCGGCCGCGCCTAGGTAGC‑3’； PCR扩增体系为：基因组DNA2μL，引物1和引物2各2μL，dNTP 4μL，10×Taq缓冲液5μL，Taq酶1μL，ddH₂O 34μL； PCR反应程序为：94°C预变性2min；94°C变性30s，然后50°C退火1min，72°C延伸1min，循环25次；最后72°C延伸10min； 回收PCR扩增产物，经限制性内切酶EcoRI和NotI双酶切，与经过同样双酶切的质粒pET‑28a在T4连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pET‑alr；(2)将重组质粒pET‑alr转化至宿主细胞中： 将重组质粒pET‑alr转化至感受态大肠杆菌BL21（DE3）中，涂布含有25μg/mL卡那霉素的LB固体培养基，37°C培养12～16h得到单克隆； (3)经抗性培养基筛选得到阳性克隆： 分别挑取单克隆于5mL含有25μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37°C、200rpm培养过夜；提取质粒，经限制性内切酶EcoRI和NotI酶切；根据电泳结果判断含有与alr基因相同分子量大小DNA片段的质粒为重组质粒pET‑alr，具有该重组质粒的菌落为阳性克隆，即为基因工程菌。