一种酶水解-气相色谱-质谱联用测定烟草中糖苷的方法

摘要

本发明公开了一种超声提取-大孔树脂固相萃取净化-酶水解-气相色谱-质谱联用测定烟草中糖苷的方法，采用β-D-葡萄糖苷酶直接对超声提取后用大孔树脂固相萃取净化的糖苷进行酶水解，然后利用气相色谱-质谱联用进行定性和相对定量分析，该方法准确，可靠，能准确鉴定24种糖苷和相对定量28种糖苷，适合不同类型烟草中糖苷成分的同时检测，克服了酸水解的非选择性、破坏性的水解方式，同时也有利于用商业化的标准谱库与文献中的保留指数进行物质确证。

主权项

一种酶水解‑气相色谱‑质谱联用测定烟草中糖苷的方法，其特征在于：测定方法包括如下步骤：（1）提取：称取一定量的烟草粉末于具塞三角瓶中，加入内标1：苯基‑β‑D‑吡喃葡萄糖苷后加入甲醇超声提取，将样品超声后取上层清液过砂芯滤斗，残留物再用甲醇超声提取一次，合并提取液，在真空、水浴条件下将甲醇浓缩至干；（2）净化：将XAD‑2大孔树脂用去离子水洗至无甲醇气味，再将XAD‑2大孔树脂装成固相萃取柱，将上述（1）浓缩物用超纯水溶解后转移至大孔树脂固相萃取柱中，先用水淋洗，再用乙醚淋洗，最后用乙酸乙酯洗脱，洗脱液干燥后真空、水浴条件下将乙酸乙酯浓缩至2 mL，再用氮气吹干；（3）酶水解糖苷：将上述（2）氮气吹干的残留物用缓冲液溶解，用体积比为1:1的乙醚和正戊烷溶液萃取2次后，向缓冲液中加入水解酶和有机溶剂混匀后放入水浴中充分反应，反应结束后冷却至室温；（4）糖苷水解物提取：加入内标2：4‑壬醇，混匀后转移至离心管中，用体积比为1:1的乙醚和正戊烷溶液萃取，有机相干燥后水浴常压浓缩至0.5 mL，待进样； （5）用气相色谱‑质谱对糖苷进行定性及定量分析，定性采用与标准物质、商业化的标准谱库NIST08 和Wiley08和保留指数NIST 数据库进行比对，其中气相色谱‑质谱分析条件如下：气相色谱柱为HP‑5ms，60m×0.25mm i.d×0.25μm d.f，进样体积：2 μL，进样口温度280 ℃，分流进样，分流比为20:1，载气为氦气，恒流模式，流速为1.0 mL/min，柱温箱为程序升温，60 ℃保持1min，以2 ℃/min升至230 ℃，保持4 min；离子源温度为230 ℃，四级杆温度为150 ℃，电离能70 eV，传输线温度为280 ℃，扫描模式为全扫描，质量范围45‑400 amu，溶剂延迟6 min。