级联侵入信号放大反应结合纳米金-寡核苷酸探针可视化核酸检测方法

摘要

本发明属于分子生物学领域，涉及级联侵入信号放大反应和纳米金-寡核苷酸探针可视化检测。本发明级联侵入信号放大反应结合纳米金-寡核苷酸探针可视化核酸检测方法包括1)第一步侵入信号放大反应，形成flap片段的积累；2)flap片段循环阶段，将flap片段与发夹探针互补杂交，形成flap片段-发夹探针特殊结构，该结构被酶识别后，发夹探针被切割；3)纳米金-寡核苷酸探针检测阶段，利用两种不同寡核苷酸修饰的纳米金探针，可视化检测级联侵入信号放大反应的结果。利用本发明检测方法，能够对核酸靶序列进行可视化检测，并且由于侵入信号放大反应具有很高的特异性，可以实现对侵入位点附近的单个碱基差异的核酸序列进行区分检测。

主权项

级联侵入信号放大反应结合纳米金‑寡核苷酸探针可视化核酸检测方法，其特征在于依次包括以下步骤：（1）级联侵入信号放大反应的第一步核酸侵入信号扩增阶段：设计针对靶核酸特异性的一对探针，要求与靶核酸杂交后，上游探针3’端必须侵入下游探针1个碱基，下游探针有一段翘起片段，称为5’flap，并且其中下游探针与靶核酸互补区域的解链温度在核酸5’外切酶或5’flap内切酶的酶切反应温度±1℃范围内，而上游探针与靶核酸互补区域的解链温度要高于核酸5’外切酶或5’flap内切酶的酶切反应温度5~10 ℃；所述的靶核酸与所述的上、下游探针在核酸侵入反应体系中杂交形成探针‑靶核酸特异性结构，其中下游探针浓度大于上游探针浓度；向反应体系中加入核酸5’外切酶或5’flap内切酶，核酸5’外切酶或5’flap内切酶识别所述的探针‑靶核酸特异性结构，并将下游探针的5’flap连同与模板配对的第一个碱基切下，因为所述的酶切反应温度接近下游探针与模板配对部分的熔解温度，下游探针被切割后会很快与靶核酸分离，没有被切割的完整的下游探针会再次与靶核酸杂交，而上游探针熔解温度高于反应温度，可以牢固地结合在靶核酸上，与新杂交的完整的下游探针再次形成所述的探针‑靶核酸特异性结构，进而继续被核酸5’外切酶或5’flap内切酶切割，形成flap片段的积累；（2）级联侵入信号放大反应的flap片段循环信号扩增阶段：反应体系中的发夹探针可捕获步骤（1）积累的flap片段，并杂交形成一个flap片段‑发夹探针特异性结构，该结构也可被反应体系中的核酸5’外切酶或5’flap内切酶识别，并将发夹探针的5’flap连同与模板配对的第一个碱基切下，被切割的发夹探针与步骤（1）产生的flap片段分离，没有被切割的完整的发夹探针会再次与步骤（1）产生的flap片段杂交，再次形成所述的flap片段‑发夹探针特异性结构，进而继续被核酸5’外切酶或5’flap内切酶切割，从而大量的发夹探针被切割；（3）级联侵入信号放大反应结果纳米金‑寡核苷酸探针可视化检测阶段：由于发夹探针5’端和3’端可分别与两种纳米金‑寡核苷酸探针互补杂交，可使得纳米金‑寡核苷酸探针形成伸展的纳米金颗粒‑多核苷酸的多聚网状结构，从而引发纳米金的特征等离子吸收发生变化，并由此引发粒子光学性质的改变，产生发夹探针的检测信号，即反应体系从红色变为紫色；当反应体系中有靶核酸存在时，可触发级联信号放大反应，在酶的作用下，大量发夹探针被切割；待级联信号放大反应结束后，向反应体系中加入两种纳米金‑寡核苷酸探针；这时，由于发夹探针被切割，不能将两种纳米金‑寡核苷酸探针连接，则不能引发纳米金的特征等离子吸收发生变化，反应体系颜色不发生变化，仍然为红色；相反，当反应体系中不存在靶核酸或靶核酸浓度过低时，则无级联信号放大反应发生或级联信号放大反应作用不明显，体系中存在的发夹探针可使得纳米金‑寡核苷酸探针形成伸展的纳米金颗粒‑多核苷酸的多聚网状结构，反应体系颜色由红色变为紫色，从而显示该体系中无靶核酸存在或靶核酸浓度过低。