一种基于固相载体上核酸扩增的基因突变检测方法

摘要

本发明公开了一种基于固相载体上核酸扩增的基因突变检测方法，将检测探针固定在检测阵列上，与PCR扩增的待测基因片段进行杂交，当目的片段被固相载体上的探针识别后，能够进行核酸序列的合成延长，使得被生物素标记的扩增片段固定在检测阵列上而不被洗脱，而不能被探针识别的序列，就不能进行序列的延长，不能通过探针被固定，进而被洗脱掉；这样通过设计多个检测探针呈矩阵式的分布，一次就可以检测出待检测基因位点的突变性质。

主权项

一种基于固相载体上核酸扩增的非疾病的诊断的基因突变检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1）针对目的基因的待测区域设计并合成PCR扩增引物对，在扩增引物的5`端增加生物素标记；提取包含目的基因的基因组DNA，以基因组DNA为模板，以生物素标记的扩增引物对进行多个循环的PCR扩增，得到PCR扩增产物，所扩增的片段长度不超过1000bp；2）针对目的基因待测区域的突变多态性，设计并合成多个长度为15～25nt的检测探针，检测探针上针对检测突变多态性的位点设置在探针5`端5nt之后；并在检测探针5`端进行减少空间位阻的序列延长修饰和/或辅助固定修饰；所述的检测探针为：探针1：C<sub>10</sub>T<sub>10</sub>‑ccttgataat ccagaagaac c；探针2：C<sub>10</sub>T<sub>10</sub>‑tccaggatca acaacaacca gt；探针3：C<sub>10</sub>T<sub>10</sub>‑tgactggaga tttgggact；探针4：C<sub>10</sub>T<sub>10</sub>‑cagcaggatg cagaggaa；探针5：C<sub>10</sub>T<sub>10</sub>‑ggtagttgat gttcctggaa g；探针6：C<sub>10</sub>T<sub>10</sub>‑ccataggaat cttgcgaaag；探针7：C<sub>10</sub>T<sub>10</sub>‑atgttcagcg cagggt；探针8：C<sub>10</sub>T<sub>10</sub>‑ttccttggag atacataggg agga；3）对固相载体的表面进行修饰后，将检测探针和对照探针呈矩阵分布的固定在固相载体上，得到固定有检测探针和对照探针的检测阵列；所述的固相载体为硝酸纤维素膜或尼龙膜，将硝酸纤维素膜或尼龙膜在2×SSC溶液中浸泡30～60min后在35～40℃条件下干燥，然后再将检测探针和对照探针均匀喷涂在硝酸纤维素膜或尼龙膜上，经50～80℃干燥30～120min，紫外光照1～10min后，得到固定有检测探针和对照探针的硝酸纤维素或尼龙膜的检测阵列；所述的对照探针包括阴性对照探针和阳性对照探针，其所设计的序列均与待检测的序列无互补性，阳性对照探针的5`端还被生物素标记；4）将PCR扩增产物进行变性处理后，置于包含DNA聚合酶和反应底物的PCR反应液中，然后再加入检测阵列，进行固相核酸扩增反应；其反应程序为：A：在不低于探针Tm值5℃的温度下退火至少10s；B：72℃延伸至少10s；A‑B循环数至少大于1；最后72℃延伸至少3min；所述的DNA聚合酶为Taq酶；5）固相核酸扩增完成后，取出检测阵列放入洗脱液中离心洗脱，去除非特异核酸的结合，用含亲和素‑碱性磷酸酶的反应液覆盖检测阵列并进行孵育，再次洗脱后用ddH₂O冲洗，最后覆盖包含NBT和BCIP的显色液进行显色，直至看到显色斑点后用ddH₂O终止反应；6）显色斑点相对应的检测探针上的检测位点与目的基因的待测区域相匹配，未显色斑点相对应的检测探针上的检测位点与目的基因的待测区域不相匹配；根据设计的检测探针及其阵列上的检测位点设计情况，对待测区域的突变多态性进行判读。