一种基于整合生物标志物法的海洋溢油污染的贝类监测方法

摘要

本发明属于生物监测环境技术领域，具体涉及一种海洋溢油污染的贝类监测方法，使用我国典型双壳贝类如菲律宾蛤仔、栉孔扇贝，测定贝类内脏团抗氧化酶活性，包括超氧化物歧化酶、谷胱甘肽转硫酶、过氧化物酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶活性等，并将这些酶活进行整合形成整合生物标志物响应指数(IBR)，建立IBR与石油浓度之间的剂量-效应关系，采用一维方差分析法(ANOVA)进行显著差异性分析，确定石油污染对生物的胁迫程度，最终判定海洋溢油的污染水平。

主权项

1.一种用于判断海洋溢油污染水平的贝类监测方法，其特征在于包括如下步骤：⑴贝类生物培养:受试生物贝类实验前洗刷干净，取回后置实验室内水族箱中暂养5～7d备用；⑵石油烃暴露实验：配置一定浓度梯度的石油烃试验液，采用半静水接触染毒法，将暂养过的贝类分成7组，其中1组为对照组，另外6组为试验组，同时每组设定3个平行组，分别放入玻璃缸中，在整个实验过程中持续充气，每隔24h换相同浓度的新鲜试验液，于第15d取样；⑶抗氧化酶活性的测定：将贝类活体解剖，取出内脏团，于液氮中研磨后称重，经灭菌生理盐水润洗，用滤纸吸干表面水分，迅速称取适量加入组织块重9倍体积的生理盐水中，冰浴匀浆后于4℃条件下3000r/min离心10min，然后取上清用生理盐水配成体积比10%组织匀浆，直接用于超氧化物歧化酶、谷胱甘肽转硫酶和过氧化物酶活性的测定，然后分别稀释成体积比5%组织匀浆用于谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶活性的测定；1%组织匀浆用于蛋白含量的测定；⑷整合生物标志物响应与石油烃浓度的剂量-效应关系：将超氧化物歧化酶、谷胱甘肽转硫酶、过氧化物酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶活性进行整合，形成整合生物标志物响应指数IBR：计算每个试验水平生物标志物3次重复样的平均值X；数据标准化：X标准化得到Y，Y=(X-m)/s，其中m和s是计算每一个生物标志物所有试验水平的总体平均值和标准偏差；当生物标志物的响应为受活化时，Z=Y；当生物标志物的响应为受抑制时，Z=－Y；对于每一个生物标志物所有试验水平的Z值最小值为Min，将其绝对值与Z相加得到得分S，S=Z+|Min|，S≥0；利用星状图表示生物标志物的结果，星状图的每个半径坐标对应每次试验水平的一个生物标志物的得分S；以Si和Si+1代表星状图中顺时针方向上的两个连续得分，n为半径的数目，也就是测定的生物标志物的个数；Ai为第i个和第i+1个半径相连形成的面积，可通过下式计算：其中α=2π/n，S_n+1=S₁；总面积即为整合生物标志物响应（IBR），$\mathrm{IBR}=\underset{i=1}{\overset{n}{\Sigma }}{A}_i;$绘制IBR与石油烃含量的剂量-效应关系，结果呈现出显著的线性关系；⑸海洋溢油污染贝类监测评价：海洋溢油事故发生后，根据溢油扩散的范围设置一定数量的站位S1，S2，….St，同时在清洁海域设定对照站位S0，将已经暂养驯化的贝类转移至溢油海域的站位S1，S2，….St和对照站位S0，放置15d后取出，迅速测定溢油海域站位S1，S2，….St和对照站位S0贝类生物体超氧化物歧化酶、谷胱甘肽转硫酶、过氧化物酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶活性，并将这些抗氧化酶整合形成IBR，进行方差分析，并用均值多重比较分析法分析对照组S0与溢油站位S1，S2，….St贝类IBR的差异显著性，当P＞0.05为差异不显著，表明溢油污染对贝类没有产生明显胁迫，基本没有石油污染；当P＜0.05为差异显著，表明溢油污染对贝类中度胁迫，石油污染程度较重；当P＜0.01为差异极显著，表明溢油污染对贝类重度胁迫，石油污染程度严重。