一种菊酯类农药降解酶的制备方法

摘要

本发明涉及农药降解酶的制备方法技术领域，尤其涉及一种菊酯类农药降解酶的制备方法，包括以下步骤：1）以重组大肠杆菌{E.coliBL21(DE3)/pET-28a-est825}作为生产菌种，用甘油管将生产菌种在-86℃的温度下保存；2）种子培养；3）发酵培养；4）补料发酵培养；5）乳糖诱导；6）酶粉制备。本发明采用重组大肠杆菌高效表达菊酯类农药降解酶，最终制得的降解酶酶粉产量25~40g/L，酶粉酶活为48000~60000U/g，大大提高了菊酯类农药降解酶的产量，降低菊酯类农药降解酶的使用成本，为规模化生产菊酯类农药降解酶提供了一条有效、经济、可行的途径。

主权项

一种菊酯类农药降解酶的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：1）以重组大肠杆菌{E.coliBL21(DE3)/pET‑28a‑est825}作为生产菌种，用甘油管将生产菌种在‑86℃的温度下保存；其中，基因est825的核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示；2）种子培养：将甘油管中的生产菌种按2~4%的接种量接入摇瓶种子培养基，以转速为200~220r/min、温度为37℃、培养时间为8~10h的培养条件在恒温摇床中培养；所述摇瓶种子培养基的pH为7.0，所述摇瓶种子培养基包括以下组分：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，卡那霉素50~100mg/L；3）发酵培养：将培养好的种子液以2~5%的接种量接入装有3.75~4.5L发酵培养基的7.5L发酵罐中进行发酵培养，发酵培养的时间为24~28h，在发酵过程中通过通入无菌空气和改变搅拌转速来控制发酵液溶氧值维持在25%；所述发酵培养基的pH为 6.8，所述发酵培养基包括以下组分：甘油5~8g/L，蛋白胨3~10g/L，酵母粉3~8g/L，(NH₄)₂SO₄ 5~10g/L，MgSO₄·7H₂O 1~3g/L，KH₂PO₄ 3.4~6.85g/L，K₂HPO₄·12H₂O 5.68~11.35g/L，微量元素液1~2mL/L，卡那霉素50~100mg/L；所述微量元素液包括以下组分：CaCl₂ 2.0g/L，ZnSO₄·7H₂O 5.0g/L，MnSO₄·H₂O 0.5g/L，Na₂‑EDTA 18.0g/L，FeSO₄·7H₂O 10.0g/L，CuSO₄·5H₂O 2.5g/L，CoCl₂·6H₂O 0.2g/L，(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 0.1g/L；4）补料发酵培养：发酵培养4~6h后，流加甘油和酵母粉的混合补料液，控制菌体的比生长速率为0.1~0.2 h^‑1，补料发酵培养阶段持续的时间为10~14h；所述甘油和酵母粉的混合补料液包括以下组分：甘油300~400g/L，酵母粉60~100g/L，卡那霉素50~100mg/L；5）乳糖诱导：补料发酵培养至菌体的OD_600nm值达到100~140时，一次性添加乳糖溶液，使发酵液乳糖的浓度为5~8g/L，将温度降至30~35℃开始诱导，诱导过程中继续流加步骤4）中的混合补料液，维持发酵液中甘油的浓度为1~2g/L，乳糖诱导的时间持续8~10h；6）酶粉制备：发酵结束后，在4~8℃的温度下离心收集菌体，将菌体用pH6.5~7.0的磷酸盐缓冲液配制成质量浓度15%~20%的菌悬液，将菌悬液在4℃的温度下、150Mpa的压力下高压破碎得到破碎液，将破碎液在4℃的温度下进行高速离心制得上清液，或用低温微膜过滤制得过滤液，再将上清液或过滤液真空冷冻干燥即制得酶粉；制得的菊酯类农药降解酶的酶活力的测定方法为：以对硝基苯酚乙酸酯（pNPA）为底物，采用分光光度法测定，酶活定义为：在pH6.5、温度40℃时每分钟催化水解pNPA生成1μmol对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活单位（U），具体测定方法如下：(1)底物母液配制：称取18.1mg pNPA溶解于1mL甲醇中，即配成0.1M的底物母液，并将底物母液在4℃储存备用；(2)测定液配制：取底物母液0.4mL，缓慢加入到9.6mL pH6.5的磷酸氢二钠‑柠檬酸缓冲液中，并充分混匀，即配制好测定液；(3)酶活测定：取5μl酶液加入200μl的测定液中，使酶液和测定液在40℃的温度下反应4min制得反应液，同时以灭活酶液做空白对照，将反应液稀释至一定倍数后取300μl加入酶标板，在405nm波长处测定吸光值，根据对硝基苯酚的浓度与405nm下的吸光值所做的标准曲线，得出酶促反应所生成对硝基苯酚的量，进而计算出酶活力。