一种新疆多浪羊外周血淋巴细胞cDNA文库的构建方法

摘要

本发明涉及一种新疆多浪羊外周血淋巴细胞cDNA文库的构建方法，属于生物技术领域。具体构建方法及过程如下：(1)提取和纯化总RNA；(2)合成cDNA第一链；(3)合成cDNA第二链；(4)对产物进行消化、酶切、过柱分离及连接；(5)体外包装；(6)cDNA文库的鉴定、扩增。本发明通过建立多浪羊的cDNA文库，有利于进一步研究新疆多浪羊的免疫分子并为保存物种信息奠定坚实的基础。对于现阶段利用分子克隆技术而言，建立多浪羊的cDNA文库，用相应的探针进行标记，筛选出目的基因和与目的基因相关的基因，也是目前获取新基因的重要手段。

主权项

一种新疆多浪羊外周血淋巴细胞cDNA文库的构建方法，其特征在于：具体构建方法及过程如下：(1)提取和纯化总RNA：采集新疆多浪羊颈静脉血20mL加2mL枸橼酸钠，分离淋巴细胞，利用Trizol法提取总RNA，纯化后置于‑70℃保存备用；(2)合成cDNA第一链：以3μL总RNA(1.0μg)为模板，加入1μL SMARTIV oligonucleotide、1μL CDSIII／3，PCR Primer，混匀，瞬时离心后72℃孵育2min，冰浴2min，瞬时离心后，依次加入2μL5×First‑stand Buffer、1μL DTT、1.0μL dNTP Mix、1.0μL Power Script Reverse Transcriptase混匀，瞬时离心后42℃孵育1h，将试管放在冰上，终止第一链的合成；(3)合成cDNA第二链：将PCR仪热循环前进行95℃预加热；在反应管中加入2μL First‑Stand cDNA、80μL ddH₂0、10μL10×Advantage2PCR Buffer、2μL50×dNTP Mix、2μL5’PCR primer、2μL CDS III／3’PCR Primer、2μL50×Advantage2Polymerase Mix混匀，瞬时离心放入PCR仪内；PCR反应条件：95℃1min，95℃15s，68℃6min，22个循环，72℃延伸5min，反应产物用5μL进行琼脂糖凝胶电泳检测；(4)对产物进行消化、酶切、过柱分离及连接：双链cDNA合成后经蛋白酶K消化，SfiI酶切后用CHROMA SPIN‑400柱分离除去小于500bp的cDNA，从收集的16个组分中各取5μL，经150V，10min琼脂糖凝胶电泳，将含有所需片段的cDNA组分合并，用1／10体积的乙酸钠(3M)，1.3μL Glyecogen(20mg／mL)，2.5倍体积95％的乙醇沉淀过夜后与λTriplEx2Vector载体16℃连接24h；(5)体外包装：采用Gigapack III Gold packaging Extract对连接物进行包装；从‑80℃的冰箱中取出包装蛋白，放在手指间溶解，取3μL连接后的cDNA加入到包装蛋白中央，轻轻混匀，避免产生气泡，然后快速离心3‑5s，22℃水浴2h；孵育好后加500μL SM buffer，20μL的氯仿，轻轻混匀，瞬时离心除去细胞碎片，4℃贮存，即为cDNA初始文库；(6)cDNA文库的鉴定、扩增，包括以下步骤：第一步，cDNA初始文库滴度及重组率测定：将得到的cDNA文库按10^‑1、10^‑2、10^‑3、10^‑4稀释，各取1μL与200μL宿主菌XL₁‑Blue(0D₆₀₀=0.5)孵育15min后，铺平板，计算初始文库滴度；第二步：鉴定cDNA文库插入片段的大小：平板上随机挑取144个噬菌斑，以5’LD primer和3’LD primer为引物进行PCR扩增，其产物经电泳后鉴定插入cDNA片段的大小；第三步：文库的扩增：用5×10⁴个噬菌体与600μL宿主菌XL₁‑Blue(0D₆₀₀=0.5)孵育孵育15min后铺平板，42℃孵育6h；然后每板加入9mL的SM buffer4℃摇动洗16h后回收噬菌体和细菌悬浮液，加入氯仿至终浓度的5％(V／V)，混合均匀后于室温15min，2600g／min，离心10min后，上清用7％DMSO(V／V)混合均匀后分装置于‑70℃保存；第四步：cDNA扩增文库滴度测定将扩增后的cDNA文库按10^‑1、10^‑2、10^‑3、10^‑4稀释，各取1μL加200μL宿主菌XL₁‑Blue(0D₆₀₀=0.5)孵育15min后，铺平板，计算扩增后的cDNA文库滴度。