分离重组人干扰素α1b异构体的纯化工艺及其检测方法

摘要

一种用QHP层析和pH梯度洗脱把重组人干扰素α1b与其相关蛋白质、异构体分离纯化的工艺方法及原液检定方法。在经过细菌破碎、目标蛋白捕获、离子交换层析和单克隆抗体亲和层析初步纯化干扰素α1b基础上，进一步经过高分辨的QHP强阴离子交换层析，利用缓慢的pH梯度洗脱，除去重组人干扰素α1b的相关蛋白质、异构体，获得高纯度的重组人干扰素α1b。参照《欧洲药典》的“重组人干扰素α2检定规程”的反相高效液相色谱法来检定经所述方法纯化所得到的重组人干扰素α1b呈一个主峰。本发明分离纯化方法有益效果在于，可以提高重组人干扰素α1b质量，并且在使用单克隆抗体亲和层析的纯化工艺中，可以除去鼠IgG。

主权项

1.一种获得经C18柱反相高效液相色谱法检测呈单一主峰的高纯度的重组人干扰素α1b的纯化工艺方法，在经过细菌破碎、酸化、硫酸铵盐析、CM弱阳离子交换层析、单克隆抗体亲和层析初步纯化处理的基础上，经过高分辨的Q Sepharose High Performance强阴离子交换层析，利用缓慢的pH梯度洗脱，获得高纯度的重组人干扰素α1b，包括如下步骤： A.匀浆裂解菌体：菌体加入含有50mmol／L Tris-HCl、5mmol／L EDTA的Tris-EDTA溶液溶解，菌悬液浓度10g／ml，用压力为50MPa的高压匀浆机匀浆两次；高速连续流离心机，转速14,000rpm离心处理，收集上清液； B.盐酸酸化：在匀浆上清液中逐步加入3mol／L HCl，pH值调至2.3，静置2小时，用连续流离心机离心处理，离心机转速14,000rpm，离心处理后收集上清液； C.碱中和：用3mol／L NaOH中和pH值至7.2； D.35％硫酸铵盐析：依据上清液体积计算35％硫酸铵饱和度所需量，搅拌至硫酸铵溶解，静置2小时后离心处理，离心机转速14,000rpm，收集上清液； E.90％硫酸铵盐析：根据上清液体积计算90％饱和度所需硫酸铵量，搅拌至硫酸铵溶解，放置过夜后离心处理，离心机转速14,000rpm；收集沉淀物，用5L CH₃COONa-CH₃COOH缓冲液溶解沉淀物； F.离心处理：用高速冷冻离心机，转速4,000rpm，离心处理7min，收集上清液； G.Sephadex G-25脱盐：柱平衡，把上清液上到G-25柱，收集目标峰； H.CM Sephrose F.F弱阳离子交换层析：上样，用pH4.4的0.005mol／L CH₃COONa-CH₃COOH缓冲液平衡2CV，用0.2mol／L CH₃COONa-CH₃COOH缓冲液洗脱、收集目标峰； I.单克隆抗体亲和层析： 上样、清洗：用PBS清洗10CV； 洗脱：用pH2.5的0.1mol／L甘氨酸-盐酸洗脱，出峰时收集，峰至基线附近结束收集，用3mol／L NaOH调整pH至7.0； J.Q Sepharose High Performance层析，利用缓慢的pH梯度洗脱目标蛋白； 平衡：用Q Sepharose High Performance BufferA：pH5.5的0.04mol／L CH₃COONH₄-CH₃COOH缓冲液平衡Q Sepharose High Performance柱； 上样：用无热原水稀释样品，使电导低于7ms／cm； 用pH5.5的0.04mol／L CH₃COONH₄-CH₃COOH缓冲液平衡至UV、pH和Cond三线走平； 用Q Sepharose High Performance Buffer B：pH4.0的0.04mol／L CH₃COONH₄-CH₃COOH缓冲液梯度洗脱；柱床体积：2.0L，流速：70ml／min；洗脱梯度：先0-20％B 5min，后20％-50％B，20CV，利用缓慢的pH梯度把相关蛋白质分离开来； K.超滤浓缩； L.Sephacryl S-100分子筛层析：上样、洗脱、收集，收集液即为重组人干扰素α1b原液； 所述C18柱反相高效液相色谱检测的具体方法为： 色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；应用phenomenex C18柱，4.6mm×250mm，CV=4.15ml，孔径30nm，粒径5μm； 流动相A：70％H₂O+30％ACN+0.2％TFA； 流动相B：20％H₂O+80％ACN+0.2％TFA； 流速1.0ml／min，进行梯度洗脱；进样量40-100μl，即20-40μg，于波长210nm处检测，按面积归一化法计算重组人干扰素α1b的纯度；洗脱梯度程序如下： 。