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一种以花梗为外植体建立百合胚性愈伤再生体系的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：材料采取：在百合花期，取百合长0.5～2.0cm的花蕾，花蕾带长1～1.5cm的花梗，置于封口袋中在4摄氏度的冰箱中冷藏1周后，再进行后续操作；步骤二：愈伤诱导培养基配置：愈伤诱导培养基以MS培养基(Murashige and Skoog,1962)为基本培养基，即采用每升纯水中溶解4.43gMS粉作为愈伤诱导培养基溶液，愈伤诱导培养基溶液中还含有30g/L的蔗糖、5g/L琼脂、0.25mg/L6‑苄氨基腺嘌呤（6‑benzyladenine,6‑BA）、0.25～1.5mg/L的2,4‑二氯苯氧乙酸（2,4‑dichlorophenoxyacetic，2,4‑D)，愈伤诱导培养基溶液的pH值为5.8；将配置好的愈伤诱导培养基溶液灭菌后，在超净工作台上进行分装，即将愈伤诱导培养基溶液倒入培养皿中，待愈伤诱导培养基溶液凝固成愈伤诱导培养基后，用保鲜膜或锡纸将至少一个盛有愈伤诱导培养基的培养皿包裹好，放在无菌洁净环境下存放；步骤三：外植体接种及愈伤组织诱导：将步骤一中处理后的花蕾，在添加了洗涤精的自来水中浸泡5～30min，再在流水下冲洗0.5～2h清洗干净，然后在超净工作台上进行消毒接种；消毒方法如下：用添加了0.1%v/v吐温的1%w/v的次氯酸钠溶液，将清洗干净的花蕾进行表面消毒8～15min，然后用无菌水冲洗3遍；消毒后进行接种：用镊子和解剖刀将花蕾上的花梗切下，将长1cm的花梗接种于步骤二中制作的盛有愈伤诱导培养基的培养皿上，花梗需先切掉其端部褐化部分产生新鲜切口，然后用解剖刀在其表面处理出划痕、切口或创伤后接种，并使创伤面接触培养基表面；将接种了外植体的培养基在25摄氏度、黑暗条件下培养8～40天，完成愈伤组织的诱导，出现愈伤组织团块；步骤四：小植株再生：外植体在愈伤诱导培养基上培养40～70天后，开始分化再生出小植株，然后将外植体转接到新鲜的愈伤诱导培养基上，在照度为1800lux、12h光照/12h黑暗的光照条件下，培养90～120天后，在超净工作台上将小植株从愈伤组织团块上分离下来，转入继代培养基培养；小植株在继代培养基上生长4周后，可进行步骤六中的出瓶种植，或者不出瓶，进行步骤五中的继代以维持百合离体鳞茎再生体系，再进行步骤六中的出瓶种植；所述继代培养基以MS培养基(Murashige and Skoog,1962)为基本培养基，即每升继代培养基中添加有4.43gMS粉，继代培养基中还含有60g/L的蔗糖、4～8g/L琼脂、0～0.2mg/L6‑苄氨基腺嘌呤（6‑benzyladenine,6‑BA）、0～0.2mg/Lα‑萘乙酸（1‑Naphthaleneacetic acid,NAA），继代培养基的pH值为5.8；步骤五：小植株的继代培养：步骤四中的小植株在继代培养基上生长4周后，不出瓶，进行继代的方法是：小植株在继代培养基上生长，基生根生长健壮，根部上端转绿后，进行小植株的转接；转接方法是：在超净工作台上，将小植株取出，将其根全部切除，叶片也从基部切除，仅保留小鳞茎和少量鳞茎盘，将小鳞茎转接到新鲜的继代培养基上，继续步骤四的培养；步骤六：小植株的出瓶种植：出瓶前进行低温锻炼，将组培容器中的继代培养基上培养的小植株，在1～5摄氏度、黑暗条件下进行30～50天的低温处理；低温处理后，将组培容器中的小植株整个取出，在流水下冲洗，洗净根部的培养基，再将小植株放入网兜中，在多菌灵1000倍溶液中浸泡消毒15～30min，然后种入育苗专用介质（如Custom growing mix,Fafard）中，小植株种入育苗专用介质中的深度在1～2cm范围内，即小鳞茎顶端距土表一球高左右，进行栽培管理，即完成百合胚性愈伤再生体系的建立。 |
