在杆状病毒-昆虫表达系统中生产眼镜蛇CT和PLA₂的方法

摘要

一种在杆状病毒-昆虫表达系统中生产眼镜蛇蛇毒蛋白（CT）和磷脂酶A₂（PLA₂）的方法：利用RT-PCR的方法从眼镜蛇毒腺中分离表达CT和PLA₂成熟肽的DNA序列，构建昆虫病毒表达载体BM-CT和BM-PLA₂；将携带目的基因的载体和空载体转入Sf9昆虫细胞，获得病毒颗粒；用病毒颗粒感染细胞，经SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达，用Ni柱洗脱的方法从细胞裂解上清中纯化出CT和PLA₂。用小鼠的扭体实验检测其镇痛活性，结果显示，CT处理组小鼠的扭动次数显著低于PLA₂处理组和对照组，说明获得的CT具有镇痛活性，效果好于PLA₂；PLA₂处理组鼠的扭动次数显著低于对照组，说明获得的PLA₂也具有镇痛活性。本发明涉及的CT和PLA₂蛋白可作为镇痛剂，应用于临床医学镇痛药物的开发利用和基础医学的研究。

主权项

一种在杆状病毒‑昆虫表达系统中生产眼镜蛇CT和PLA₂蛋白的方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：（1）从眼镜蛇毒腺提取总RNA，反转录为cDNA，通过PCR方法获得编码眼镜蛇CT和PLA₂蛋白的核苷酸序列，核苷酸序列分别如SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2所示；（2）将眼镜蛇蛇毒蛋白（Cobrotoxin，CT）和磷脂酶A₂（Phospholipase A₂，PLA₂）蛋白的核苷酸序列克隆到昆虫杆状病毒载体pFastBac Dual^TM中，再通过转座获得BacMid重组质粒，在昆虫Sf9细胞中表达CT和PLA₂蛋白；（3）采用亲和层析方法对CT和PLA₂蛋白进行纯化，从而得到目的蛋白CT和PLA₂，其氨基酸序列分别如SEQ ID No: 3和SEQ ID No: 4所示。