一种构建TAL效应子和TALENs的简化方法及质粒

摘要

本发明公开了一种构建TAL效应子和TALENs的简化方法及质粒，具体是通过研究发现dTALE的半个重复(LHR)是可以省略的，因而设计并构建了一个通用的RAR质粒pSK-RAR-U。由于通用RAR质粒pSK-RAR-U能够接受任何一个通过单元装配法组装的dTALE重复区，进而构建dTALEs表达载体的方法简化为：第一步为dTALE重复区序列组装，第二步为将dTALE重复区序列克隆到pSK-RAR-U中。本发明优点是为dTALEs和TALENs的构建提供了更简便的方法，节约时间和成本。

主权项

一种通用载体pSK‑RAR‑U的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：第一步，以含有avrXa23基因的pBluescript SK+质粒即pSK‑avrXa23质粒DNA为模板，分别用引物对TalenF1/TalenR1、TalenF2‑U/TalenR2进行PCR扩增，将扩增出的两个PCR产物混合作模板，再用引物对TalenF1/ TalenR2进行搭桥PCR；第二步，将扩增出的片段回收，与pEASY‑Blunt载体重组连接，测序正确的克隆用SphI酶切；第三步，将酶切片段克隆到中间载体pSK‑avrXa23ΔSphF‑XH载体，构建成通用的重复可变区受体质粒载体，命名为pSK‑RAR‑U；其中，所述TalenF1、TalenR1、TalenF2‑U、TalenR2的序列分别是SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.15；其中，所述中间载体pSK‑avrXa23ΔSphF‑XH载体构建方法如下：(1) 将(pSK‑avrXa23用SphI酶切，去除SphI酶切的DNA片段，将含有avrXa23的N端和C端DNA序列的载体在T4连接酶作用下自连，形成的载体命名为pSK‑avrXa23ΔSphF，其中avrXa23没有SphI片段；(2) 用引物avrXa23F6和avrXa23R6，以pSK‑avrXa23ΔSphF载体为模板进行PCR扩增，扩增片段重组到pBluescript II SK的SmaI酶切线性DNA上，形成的中间载体即为pSK‑avrXa23ΔSphF‑XH；所述引物avrXa23F6和avrXa23R6的序列分别为SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5。