一种新型抑芽剂的制备方法

摘要

本发明提供了一种活性成分为β-苯乙醇的生物新型抑芽剂的制备方法，包括样本采集、培养基培养和固体发酵三个步骤，在固体发酵中又包括了一级菌种培养、二级菌种液培养、三级放大培养、固体发酵室的灭菌、固相发酵菌丝、通风干燥、代谢产物的提取、粗产品获得和活性组分分离的等步骤。本发明制成的抑芽剂有效率达到92-98%，整个生产过程安全无毒，且通过固体发酵的方法发酵过程简单，生产设备投入小，且产物的浓度更高，受杂菌污染的风险小。

主权项

一种新型抑芽剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1）标本采集：先从植物中采集Botrytis Cinerea Persr真菌CGMCC NO0357‑1的病害标本，从中选择新鲜、症状典型的标本进行表面消毒，用灭菌水冲洗后，再用组织分离或直接孢子振落法，进行单孢分离、纯化培养；2）培养基培养：将纯化培养后的菌株进行培养基培养，在培养箱温度24℃的情况下，采用PDA培养基，培养48小时；3）固体发酵：一级菌种培养：在无菌操作的条件下，将经过步骤2）培养后的菌种转接到三角瓶中，其菌种体积为三角瓶体积的1/3左右，然后置于无菌培养室的旋转式摇床，在25℃的温度下培养48个小时，直到菌丝达到肉眼可观察到的浓度；二级菌种液培养：将经过一级菌种培养的菌丝按1：5比例接种到已灭菌的发酵罐中，发酵液溶积占罐容的2/3左右，然后通入无菌空气，在25℃下培养24小时，形成菌丝较为浓密的高浓度菌丝液；三级放大培养：将经过二级菌种培养的菌丝按1：10比例接种到已灭菌的发酵罐中，发酵液溶积占罐容的1/3左右，然后通入无菌空气，在25℃下培养观察其生长情况，待形成菌丝更为浓密的高浓度菌丝液后放入罐拌料；固体发酵室的灭菌：按照甲醛、高锰酸钾的质量份为2：1的比例混合后熏蒸，熏蒸的范围为甲醛15‑30克/M³，时间为24小时；同时将培养盘放在固体发酵室内，同固体发酵室一起熏蒸，固相发酵菌丝：将麦麸、稻糠和水按照2：8：3的比例混合后分装成小袋的混合料，在1.45Mpa下灭菌40分钟，待冷却后按2：1的比例将混合料与经过三级放大培养的发酵液搅拌混匀，然后平摊到经过上述熏蒸的培养盘中，使其厚度为4‑6cm，填料后，培养盘置于上述经过熏蒸的固体发酵室开放培养，温度控制在22‑24℃左右，前期每隔1‑2小时测定温度湿度，如果湿度低于80%，则喷适量的无菌水将温度提高1‑2℃，同时降低湿度，保持该状态5个小时后转入通风干燥阶段；通风干燥：将培养盘上的固体料转入干燥设备内，通风干燥，干燥过程中温度控制在26‑30℃左右，干燥期间测试湿度，湿度低于4%后可停止干燥；代谢产物的提取：将干燥后的固体料打碎后放入提取罐，用有机溶剂乙酸乙酯提取代谢产物，提取后放入浓缩罐，浓缩分离出带有清香味膏状、溶于水和酒精的褐色产物；粗产品获得：将提取的褐色产物稀释为100倍、200倍……1200倍系列浓度各5毫升，移入放有经过清洗杀菌的小麦种子的烧杯中，以刚好浸没种子为宜，对照用清水，每一浓度重复3次，置26℃温箱中培养7天，筛选出活性强，产率高的菌株培养所得粗品；活性组分分离：经生测筛选盗活性较高的组分，再用柱层析和TLC法纯化，HPLC分析，应用IRV、UV、MS，结合HNMR仪器解析，确定活性成分β‑苯乙醇的分子量、分子式和结构式。