主权项 |
一种人羊膜间充质干细胞的分离方法,其应用于酶消化法联合EGF培养人羊膜间充质干细胞的过程,所述培养过程包括如下步骤:hAMSCs的分离,hAMSCs的原代培养,hAMSCs的传代培养与扩增,hAMSCs的冻存和复苏,以及hAMSCs细胞免疫表型的检测;其特征在于,所述hAMSCs的分离步骤包括:无菌条件下取产后弃置的新鲜胎盘,采用机械法将羊膜从胎盘组织上剥离,用D‑Hanks液冲洗数次以清除残留血迹,将漂洗后的羊膜用眼科剪剪成约1mm<sup>3</sup>碎块,加入胰蛋白酶37℃消化10分钟;加入含小牛血清的DMEM终止消化,并轻柔吹打混匀后200目细胞筛过滤;过滤后的羊膜组织中加入II型胶原酶消化液,37℃消化30分钟;加入含小牛血清的DMEM终止消化,轻柔吹打混匀后200目细胞筛过滤,收集细胞;1000转/分钟离心5分钟;台盼兰染色计数活细胞,调整细胞密度为1×10<sup>6</sup>/ml,接种至培养瓶,加入含bFGF和FBS的DMEM培养基;置37℃、饱和湿度、体积分数5%的CO<sub>2</sub>培养箱内培养;倒置相差显微镜下每日观察原代和传代细胞的生长情况和形态特征,隔天换液1次,并摄片记录;待细胞汇合度达80%后,用0.25%胰蛋白酶‑0.02%EDTA溶液于37℃消化2‑3分钟,加入培养基终止胰蛋白酶作用,1000转/分钟离心5分钟,弃上清,细胞沉淀用培养基重新悬浮后,以1×10<sup>7</sup>/ml的细胞密度传代;以及传代过程中,隔日换液1次,待细胞长满70%瓶底重复以上步骤。 |