一种基于级联恒温扩增的miRNA荧光检测试剂盒及方法

摘要

本发明公开了一种基于级联恒温扩增的miRNA荧光检测试剂盒及方法，通过核酸互补杂交，目标miRNA可以特异性识别与三元探针并形成稳定的三元杂交结构；三元杂交结构中的三元引物沿着三元模板起始链置换扩增反应并产生大量的SDA模板产物；SDA模板产物可以打开双功能发卡探针，最终触发切口酶信号放大反应，循环酶切分子信标，产生级联放大的荧光信号。本发明可以检测低至100fM的miRNA；该检测方法具有超高的特异强，能够很好区分不同错配位置的高度同源序列，从而解决了现有检测方法中由于特异性不强而导致假阳性结果的难题。

主权项

一种基于级联恒温扩增的miRNA荧光检测试剂盒，其特征在于，包括：能够与miRNA形成三元杂交结构的组合物，包括3‑WJ引物和3‑WJ模板，3‑WJ引物由两部分序列组成：其5'端部分与目的miRNA3'端部分互补，3'端部分与3‑WJ模板的中间段互补；3‑WJ模板由三部分序列组成：其5'端部分与目的miRNA5'端部分互补，中间段与3‑WJ引物3'端部分互补，其3'端部分为含核酸切口酶识别位点的SDA模板区域；扩增底物，包括dNTPs混合物；DNA分子机器工具，包括具有链置换扩增活性的DNA聚合酶和核酸切口酶；SDA模板与目的miRNA杂交后触发DNA分子机器工具，产生SDA模板产物；具有发卡结构的发卡分子H，能够与SDA模板产物相识别，在识别后杂交打开发卡结构；具有茎环结构的分子信标探针，其两端分别标记有荧光基团和猝灭基团，分子信标探针具有能够与被打开的发卡分子H相互补的序列；以及DNA分子机器扩增反应缓冲液。