一种无抗生素标记的植物表达载体及其构建方法与应用

摘要

本发明公开了一种无抗生素标记的植物表达载体及其构建方法，该载体的T-DNA区含有一个基因盒，由CaMV 35S启动子、Xba I、Bam HI和XmaI核酸限制性酶酶切位点、异戊烯基转移酶基因(isopentenyl transferase，ipt)和nos终止序列组成。构建该载体的方法是以双元载体pBI121为基础，用ipt基因替换gus基因，通过Bsu 36I和Xba I酶切位点删除npt II基因，重新将CaMV 35S启动子连接到T-DNA区。采用本发明提供的技术方案，在含适量低浓度细胞分裂素类生长调节剂的培养基上可诱导再生转基因植株，所获得的转基因植株就是目的基因表达的转基因植株，可减少鉴定目的基因是否表达的步骤，并避免抗生素标记基因的潜在风险性。

主权项

一种无抗生素标记的植物表达载体，其特征是：其中T‑DNA含有一个基因盒，该基因盒从5’到3’端依次由花椰菜花叶病毒RNA基因35S（CaMV35S）启动子、目的基因、ipt筛选标记基因和nos终止序列组成；所述的无抗生素标记的植物表达载体的构建方法，包括下列步骤：（1）利用Xma I和Sac I限制性内切酶删除pBI121质粒上的gus基因片段，将两端具有Xma I和Sac I限制性内切酶位点的ipt基因连接到该质粒的T‑DNA区，得到携带ipt基因的pBI121质粒；（2）利用Bsu36I和Xba I限制性内切酶酶切删除携带ipt基因的pBI121质粒上的35S启动子、npt II基因和nos启动子3’端‑120bp，回收10487bp片段，将两端具有Bsu36I和Xba I限制性内切酶位点的35S启动子连接到pBI121的10487bp片段上，得到无抗生素标记的植物表达载体，将其命名为pBI201；（3）利用Xba I、Bam HI和Xma I限制性酶酶切位点，将目的基因重组到pBI201表达载体的T‑DNA区，得到携带目的基因的植物表达载体；所述的ipt基因编码序列是从根癌土壤杆菌C58胭脂碱型Ti质粒中克隆的，克隆方法为：PCR扩增根癌土壤杆菌C58胭脂碱型Ti质粒的ipt基因序列，将其连接到pGEM‑T载体，转化大肠杆菌JM109，筛选克隆菌，提取质粒，酶切与DNA测序，鉴定克隆的ipt基因序列，碱基数量为723bp，其编码序列如SEQ NO：2所示的氨基酸序列。