表达小鼠神经生长因子的重组腺病毒及其制备方法

摘要

本发明提供一种表达小鼠神经生长因子的重组腺病毒载体的构建，应用基因工程技术，将小鼠神经生长因子基因插入到载体巨细胞病毒启动子的下游，将重组的穿梭质粒与病毒骨架质粒共转化大肠杆菌DH5ɑ感受态细菌，获得含有目的基因的重组腺病毒质粒载体。将该腺病毒质粒载体转染293T细胞，获得带有小鼠神经生长因子基因的重组腺病毒载体，所构建的含NGF基因腺病毒载体，经过并将其转染到糖尿病小鼠心脏，可明显改善心脏感觉神经传导功能，减轻糖尿病神经末梢病变程度。所述腺病毒载体可在制备治疗糖尿病合并冠心病药物中的应用。

主权项

一种表达小鼠神经生长因子的重组腺病毒载体的构建方法，其特征在于，通过以下步骤实现：（1）重组质粒的构建从美国国立生物技术信息中心获得小鼠神经生长因子的基因序列，序列号NM_001112698，获取cDNA模板及引物，PCR法扩增目的基因:神经生长因子，    所述PCR法中使用的引物1: GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGTCCATGTTGTTCTACACTC ，引物2: TCACCATGGTGGCGACCGGGCCTCTTCTTGTAGCCTTC，引物3：GGTATAAGAGGCGCGACCAG，引物4：CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG，其中引物1和引物2作为目的基因小鼠神经生长因子的反应引物，引物3和引物4作为重组克隆的PCR鉴定引物，PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测有无目的基因，将GV135腺病毒载体用限制性内切酶AgeI酶切，酶切位点为5＇A＾CCGGT3＇，获得线性化表达载体，通过引物1 GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGTCCATGTTGTTCTACACTC 和引物2 TCACCATGGTGGCGACCGGGCCTCTTCTTGTAGCCTTC，在PCR产物两端引入GV135载体的一段交换臂，由于重组酶的作用PCR产物和载体在交换臂处进行交换连接，连接后，以氯化钙沉淀法转化大肠杆菌DH5α，接种于含有氨苄抗性的琼脂平皿，挑选阳性菌落，用小量质粒提取试剂盒提取质粒，而后1.2%琼脂糖凝胶电泳，鉴定阳性克隆，并对阳性质粒进行测序；（2）重组腺病毒的包装产生将购于上海吉凯基因化学技术有限公司的293T细胞接种于培养板内，每60mm的培养板中接种7–8 × 10⁵个细胞，培养至细胞密度达70%时转染，取5μg上述已制备的过表达重组质粒，加入25μl的CaCl₂ 、250μl的N,N‑二(2‑羟乙基)‑2‑氨基乙磺酸BES缓冲液，混匀后室温孵育10分钟，逐滴加入60mm的培养板中，混匀后将培养板放入37℃ 5%CO₂的孵箱中培养，转染8天后，观察到大部分细胞浮起，细胞变大变圆，胞核增大，即进行细胞收集，产生重组腺病毒载体，其编码序列为SEQ ID NO:2。