一种文库对文库的酵母双杂交规模化筛选互作蛋白质的方法

摘要

本发明公开了一种文库对文库的酵母双杂交规模化筛选互作蛋白质的方法，以基因组规模的cDNA作为Bait筛选同样是基因组规模的cDNA Library。在本技术实施过程中采取对cDNA文库进行均一化处理的方法来降低高丰富度互作蛋白对低丰富度互作蛋白的掩盖作用，提高了筛选的效率；利用酵母URA3基因的特性自动的去除baitc DNA中具有自激活作用的序列。本发明建立了一种可行性高，成本低廉，实验条件要求低，工作量较小的利用文库对文库的酵母双杂交技术大规模筛选互作蛋白质的方法，并成功的应用于了病原物-寄主植物互作蛋白质的筛选。

主权项

一种文库对文库酵母双杂交规模化筛选互作蛋白质的方法，步骤如下：（1）均一化诱饵cDNA文库和猎物cDNA文库的构建：提取目标生物组织总RNA，纯化获得mRNA，分别以GBK‑SMART Ⅲ和GBK‑CDS Ⅲ，SMART Ⅲ和 CDS Ⅲ为引物进行RT‑PCR反应，对生成的第一链cDNA再分别以BD 5’ PCR primer和BD 3’ PCR primer，AD 5’PCR primer和AD 3’PCR primer为引物通过LD‑PCR反应进行扩增获得未均一化的双链cDNA文库，然后按照DSN法对上述两个cDNA文库进行均一化处理并以BD 5’ PCR primer和BD 3’ PCR primer，AD 5’PCR primer和AD 3’ PCR primer对相应的文库进行扩增，获得足够量的均一化的诱饵cDNA文库和猎物 cDNA文库；所述引物如下： GBK‑SMART Ⅲ5’‑CTGATCTCAGAGGAGGACCTGCATATGGCCATGGAGGCCrGrGrG‑3’GBK‑CDS Ⅲ：5’‑CGGCCGCTGCAGGTCGACGGATCC‑d(T)₃₀VN‑3’SMART Ⅲ：5’‑AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGCCGGG‑3’CDS Ⅲ：5’‑ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG‑d(T)₃₀VN‑3’BD 5’ PCR primer：5’‑GAGCAGAAGCTGATCTCAGAGGAGGACCTGCATATGGC‑3’BD 3’PCR primer：5’‑GGGTTATGCTAGTTATGCGGCCGCTGCAGGTCGACGGA‑3’AD 5’PCR primer：5’‑TTCCACCCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGG‑3’AD 3’ PCR primer：5’‑GTATCGATGCCCACCCTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACA‑3’（2）大规模转化诱饵cDNA文库、猎物cDNA文库：将上述构建好的诱饵cDNA文库按照Clontech公司Yeastmaker^TMYeast Transformation System 2试剂盒操作说明与线性化的质粒pGBKT7共转化酵母菌株MaV203，猎物cDNA文库与线性化的质粒pGADT7共转化酵母菌株Y187，获得转化入酵母菌株中的诱饵cDNA文库和猎物cDNA文库；（3）含有cDNA文库的酵母菌株的收集及诱饵cDNA文库中自激活序列的去除：将构建有猎物cDNA文库的Y187菌株涂布SD/‑Leu酵母平板培养基，将构建有诱饵cDNA文库的酵母MaV203涂布含0.2﹪5‑FOA的SD/‑Trp酵母平板培养基，30℃放置3～5天，冲洗收集生长的克隆，即获得构建进酵母菌株Y187中的猎物cDNA文库和去除自激活序列的酵母菌株MaV203中的诱饵cDNA文库；（4）构建以酵母菌株Y2HGold为载体的诱饵cDNA文库：将上述去除自激活序列的诱饵cDNA文库离心收集，Clontech公司Easy yeast plasmid Isolation kit提取质粒，获得的质粒利用Yeastmaker^TMYeast Transformation System 2试剂盒转化酵母菌株Y2HGold；（5）大规模酵母双杂交筛选互作蛋白质：上述构建好的Y2HGold菌株中的诱饵cDNA文库和Y187菌株中的猎物cDNA文库混合杂交，通过两重选择培养基的筛选获得报告基因被激活表达的阳性克隆，对互作双方的插入片段进行测序及分析。