藏绵羊肌肉生长抑制素重组表达蛋白质

摘要

本发明公开了一种重组藏绵羊肌肉生长抑制素蛋白质。包括克隆藏绵羊肌肉生长抑制素编码基因MSTN，以该基因为模板PCR扩增并克隆MSTN生物活性区，构建重组表达载体，并转化到大肠杆菌构建基因工程菌，对工程菌进行IPTG诱导表达并纯化MSTN蛋白质。随后用MSTN蛋白质主动免疫家兔制备多克隆抗体血清，用间接ELISA法检测MSTN蛋白质免疫原性。用重组藏绵羊MSTN蛋白质主动免疫小鼠，检测重组MSTN蛋白质对小鼠生长发育的影响。本发明提供的重组藏绵羊MSTN蛋白质纯度高，免疫原性好，主动免疫MSTN蛋白质可使小鼠肌纤维直径、面积显著增加，且肌纤维数量也有增加的趋势。由此提示，重组藏绵羊MSTN蛋白质可用于藏绵羊主动免疫，有利于加快藏绵羊生长速度，提高产肉性能。

主权项

一种藏绵羊MSTN重组蛋白质的制备方法，其特征在于包括以下步骤： 1).重组载体转化到宿主菌；2).重组蛋白质的IPTG诱导表达；3).重组蛋白质的纯化；4).重组蛋白质的复性；其中，步骤1）重组载体转化到宿主菌包括：将重组载体pET28a(+)‑MSTN′经转化到E.coliBL21(DE3)宿主菌中得到藏绵羊pET28a(+)‑MSTN′‑E.coliBL21(DE3)工程菌，所用宿主菌为E.coli BL21(DE3)感受态细胞；转化得到藏绵羊pET28a(+)‑MSTN′‑E.coliBL21(DE3)工程菌后经质粒PCR、质粒双酶切及DNA测序法筛选阳性重组质粒，得到鉴定正确的pET28a(+)‑MSTN′‑E.coliBL21(DE3)工程菌；所述重组载体pET28a(+)‑MSTN′是将MSTN′片段连接到pET28a(+)线状载体，转化到E.coli TOP10宿主菌，用质粒PCR、质粒双酶切及DNA测序法筛选阳性重组质粒所得到，它包含序列表中序列5的3′端330个核苷酸组成的藏绵羊myostatin成熟肽基因MSTN′和pET28a(+)载体，该藏绵羊myostatin成熟肽基因MSTN′位于pET28a(+)载体的EcoRⅠ和BamHⅠ限制性内切酶酶切位点之间；步骤2）所述重组蛋白质的IPTG诱导表达包括以下步骤：（1）经鉴定正确的pET28a(+)‑MSTN′‑E.coliBL21(DE3)基因工程菌接种于含卡那霉素的LB培养基中，37℃、120r/min 震荡培养过夜，基因工程菌菌液与LB培养基的体积比为1:100；（2）次日，将过夜培养后的基因工程菌以1：40的体积比例接种到含Kan的LB培养基中，于37℃震荡培养；（3）细菌OD₆₀₀=0.5～1时，加入1mM IPTG，30℃，诱导表达5‑9小时；（4）4000r/min离心5min，收集菌体，溶于含尿素的PBS缓冲液中，4℃、12000r/min离心10min，取上清加入等体积2×SDS样品缓冲液，煮沸5min，进行SDS‑PAGE电泳，所述SDS‑PAGE电泳的分离胶浓度为15%，浓缩胶浓度为5%；步骤3）所述重组蛋白质的纯化包括以下步骤：（1）包涵体分离：经步骤2）IPTG诱导的表达菌，4℃、12000r/min离心15min，收集菌体；a、按1g菌体湿重加入10mL pH 7.4的PBS缓冲液洗涤2次；b、菌体悬液于冰上超声破碎20min，破碎5s、间断9s，4℃ 12000r/min离心15min，收集沉淀；c、按1g菌体湿重加入20mL含0.1%体积比的 Triton X‑100、pH 7.4的PBS缓冲液，重悬沉淀，4℃静置20min，反复洗涤5次；d、按1g菌体湿重加入20mL含2M Urea、pH 7.4的PBS缓冲液，重悬沉淀，4℃静置20min，反复洗涤5次,收集沉淀；e、用蛋白质溶解液溶解沉淀，按1g菌体湿重加入10mL蛋白质溶解液，4℃溶解过夜，4℃ 12000r/min离心30min，收集上清液，经0.45μm滤膜过滤备用，所述蛋白质溶解液包括pH 7.4的PBS缓冲液、8M Urea；（2）重组蛋白质纯化：    将上述经滤膜过滤后的上清液用Ni²⁺螯合层析柱纯化目的蛋白：将 Ni²⁺螯合层析柱接入低压层析系统，用蛋白质溶解液充分平衡，上样；用洗脱液A洗脱杂蛋白；然后用含500mM咪唑的洗脱液B洗脱目的蛋白，收集洗脱峰；SDS‑PAGE蛋白质电泳检测洗脱效果；所述洗脱液A包括PBS缓冲液 pH 7.4、8M Urea、20mM咪唑，所述洗脱液B包括PBS缓冲液 pH 7.4、8M Urea、500mM咪唑；步骤4）所述重组蛋白质的复性包括： 将上述纯化得到的包涵体蛋白用尿素浓度梯度法4℃透析复性，透析缓冲液依次以含6M、5M、4M、3M 、2M、1M 、OM尿素的PBS缓冲液，最后以无尿素的PBS缓冲液4℃透析过夜。