源自记忆B细胞的人单克隆抗体的快速表达克隆

摘要

本发明提供了无需利用杂交瘤细胞技术的人单克隆抗体的制备方法，采用所述的方法制备的抗体，以及采用该抗体治疗和预防病症(如人类免度缺陷病毒的病原体感染)的方法。

主权项

一种用于制备特异性结合特定已知抗原的单克隆抗体的方法，包括步骤：(1)分离记忆B细胞：从一个已接触过所述特定已知抗原的动物中获取的血液样本中分离出记忆B细胞；(2)筛选记忆B细胞：筛选能够分化成能稳定产生所述单克隆抗体的浆细胞的记忆B细胞(b)培养记忆B细胞：有限稀释培养所分离出的记忆B细胞7～14天，以允许所述记忆B细胞分化为能稳定产生单克隆抗体的浆细胞；(c)确定所述浆细胞是否能产生特异性结合所述特定已知抗原的单克隆抗体；(d)如果所述浆细胞能产生特异性结合所述特定已知抗原的所述单克隆抗体，则从所述浆细胞中分离出总RNA，而如果所述浆细胞不产生所述单克隆抗体，则重复步骤(b)‑(d)，直到所分离出的记忆B细胞被鉴定为分化成能稳定产生所述单克隆抗体的浆细胞；(e)从所述浆细胞中分离出总RNA；(f)使用在步骤(e)中分离出的总RNA来制备总RNA中的编码抗体重链可变区(VH)的mRNA分子的cDNA和编码抗体轻链可变区(VL)的mRNA分子的cDNA；(g)将VH链cDNA克隆到真核表达载体，并将VL链cDNA克隆到真核表达载体；(h)选择包含VH链cDNA的表达载体制备VH链微型库，并选择包含VL链cDNA的表达载体制备VL链微型库；(i)用包括来自VH链微型库的VH链cDNA的表达载体的混合物和包括来自VL链微型库的VL链cDNA的表达载体的混合物共转染恰当的宿主细胞，使共转染细胞生长达足够长的时间，以允许这些细胞能稳定地产生抗体；(j)确定所述共转染细胞产生特异性结合所述特定已知抗原的单克隆抗体；(k)鉴定编码了如步骤(j)中单克隆抗体的VH链的VH链cDNA，其包括步骤：(i)用从VH链cDNA微型库中获得的特定VH链cDNA表达载体和包括来自VL链微型库的VL链cDNA表达载体的混合物共转染恰当的宿主细胞，使该共转染细胞生长达足够长的时间，以允许该共转染细胞形成能稳定产生抗体的克隆；(ii)确定该克隆是否产生特异性结合特定已知抗原的单克隆抗体；(iii)如果该共转染细胞产生了特异性结合特定已知抗原的单克隆抗体，则继续进行步骤(k)之(iv)，而如果该共转染细胞不产生单克隆抗体，则使用不同的特定VH链cDNA表达载体来重复步骤(k)之(i)和步骤(k)之(ii)，直到特定VH链cDNA表达载体被鉴定为可产生单克隆抗体；(iv)鉴定产生单克隆抗体的VH链cDNA，并选择用来制备产生特异性结合特定已知抗原的单克隆抗体的克隆的VH链cDNA表达载体；(l)鉴定编码了如步骤(k)中的单克隆抗体的VL链的VL链cDNA，包括步骤：(i)用在步骤(k)之(iv)中鉴定的VH链cDNA的表达载体和选自VL链微型库的特定VL链cDNA表达载体共转染恰当的宿主细胞，使该共转染细胞生长达足够长的时间，以允许该共转染细胞形成能稳定地产生抗体的克隆；(ii)确定该克隆是否产生特异性地结合特定已知抗原的单克隆抗体；(iii)如果该克隆产生了特异性地结合特定已知抗原的单克隆抗体，则继续进行步骤(l)之(iv)，而如果该共转染细胞不产生单克隆抗体，则用不同的特定VL链cDNA的表达载体重复步骤(l)之(i)和步骤(l)之(ii)，直到特定的VL链cDNA表达载体被鉴定出产生单克隆抗体;(iv)鉴定编码单克隆抗体的VL链的VL链cDNA，并选择用于制备产生单克隆抗体的克隆的VL链cDNA表达载体；以及(m)用步骤(k)之(iv)鉴定的VH链cDNA的表达载体和用步骤(l)之(iv)鉴定的VL链cDNA的表达载体共转染恰当的宿主细胞，以制备能够产生特异性结合特定已知抗原的单克隆抗体的宿主细胞，从而产生结合特定已知抗原的单克隆抗体。