耐甲氧西林金黄色葡萄球菌重组基因工程疫苗候选抗原I₁₂C制备中的纯化方法

摘要

本发明涉及一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌重组双亚单位基因工程疫苗候选抗原I₁₂C制备中的纯化方法，其包含步骤：收集制备的所述抗原；高压破菌、离心，硫酸铵分步沉淀，GST亲和层析、PP酶切、缓冲液置换、Resource Q层析、凝胶过滤层析技术的顺序组合对制备的I₁₂C抗原进行纯化。本发明提供的纯化方法简捷、容易放大、重复性好，所获目标蛋白纯度高，动物试验证明纯化的抗原可有效刺激机体产生较高的体液免疫应答和良好的免疫保护作用，采用本发明方法纯化的抗原I₁₂C，其纯度≥99%。

主权项

一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌重组双亚单位基因工程疫苗候选抗原I₁₂C制备中的纯化方法，其特征在于，该抗原I₁₂C的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，其纯化方法包括以下步骤：A）收集自构建表达抗原I₁₂C的大肠杆菌工程菌高密度发酵的菌体；B）采用高压破菌、离心，硫酸铵分步沉淀，GST亲和层析、PP酶切、缓冲液置换、Resource层析、凝胶过滤层析技术的顺序组合对制备的I₁₂C进行纯化，获得了高纯度的I₁₂C；所述步骤B具体如下：1）高压破菌：将高密度发酵的抗原I₁₂C的大肠杆菌菌体以pH7.0‑7.5的10‑20mM PBS缓冲液混匀悬浮，预冷后采用高压匀浆破菌，高速离心，收集上清；2）硫酸铵分步沉淀：4℃搅拌条件下，上清中缓慢加入终浓度为30%的硫酸铵，搅拌半小时，10000‑15000g高速离心20分钟，收集上清；上清中继续缓慢加入终浓度为40%的硫酸铵，搅拌半小时，10000‑15000g高速离心20分钟，收集沉淀；3）沉淀复溶：称量沉淀湿重，按重量：体积比1：10比例加入pH7.0‑7.5的10‑20mM PBS缓冲液，搅拌混匀10‑15分钟，10000‑15000g高速离心20分钟，收集上清；4）GST亲和纯化：选择GST亲和层析填料进行初步纯化，使用PBS ‑Tween80 pH7.0‑7.5条件下对目标蛋白进行纯化，Prescission Protease酶（PP酶）进行酶切洗脱；5）缓冲液置换：使用缓冲液10‑20mM PB，pH7‑9，5% 甘油，1mM EDTA平衡层析系统及Desalting 层析柱，将步骤4）获取的样品通过Desalting 层析柱；6）Resource层析纯化：步骤5）收集的样品，使用步骤5）所述缓冲液平衡层析系统及Resource层析柱，采用换缓冲液10‑20mM PB，1 M NaCl， pH7‑9，5% 甘油，1mM EDTA梯度洗脱；7）凝胶过滤层析纯化：将步骤6）纯化获得的样品，使用凝胶过滤Superdex层析柱纯化，采用缓冲液10‑20mM PBS, pH7.0‑7.5平衡层析系统及层析柱，去除痕量非目标蛋白杂质，分离纯化目标蛋白，置换缓冲液。