一种检测人巨细胞病毒PP65抗原的ELISA方法

摘要

本发明涉及一种检测人巨细胞病毒（HCMV）PP65抗原的ELISA方法，它是一种检测HCMV活动性感染指标的临床检测方法。本发明主要是解决现有HCMV活动性感染检测方法存在的敏感性或特异性低、费时费力、操作繁琐和使用不便的问题。本发明采用的技术方案是：一种检测人巨细胞病毒PP65抗原的ELISA方法，其包括下列步骤：1）制备检测试剂盒：所述检测试剂盒包括：包被有大鼠抗重组PP65_322-561多克隆抗体（pAb）的酶标板、兔抗重组PP65_322-561pAb、标准品、HRP-羊抗兔IgG、PBST洗涤液、底物显色液、终止液和封板膜；2）制备待测标本；3）检测人巨细胞病毒PP65抗原。本发明具有较好的特异性、敏感性、稳定性和可重复性，易于规模化和标准化操作等优点。

主权项

一种检测人巨细胞病毒PP65抗原的ELISA方法，其特征是：包括下列步骤：1）制备检测试剂盒所述检测试剂盒包括：包被有大鼠抗重组PP65_322‑561多克隆抗体（pAb）的酶标板、兔抗重组PP65_322‑561pAb、标准品、HRP‑羊抗兔IgG、PBST洗涤液、底物显色液、终止液和封板膜；①所述大鼠抗重组PP65pAb的酶标板的制备：a）大鼠抗重组PP65pAb的制备：免疫前大鼠断尾采血，分离血清，作为免疫血清效价检测的阴性对照；取70‑170μg重组PP65抗原与等体积弗氏完全佐剂混合，振荡混匀制成乳化剂，皮下及皮内多位点免疫大鼠；免疫后14‑21天，取70‑130μg重组PP65抗原与等体积弗氏不完全佐剂混合，振荡混匀制成乳化剂，第二次皮下及皮内多位点免疫大鼠；第二次免疫后21‑30天，与第二次方法一样再次加强免疫；第三次免疫后第10天，采血分离血清，ELISA检测抗体效价，证明免疫成功后，心脏采血获取免疫血清，饱和硫酸铵沉淀法纯化免疫血清，得到所需大鼠抗重组PP65的pAb；b）包被酶标板：包被液稀释大鼠抗重组PP65pAb为1︰2000，每孔50μl加入酶标板中，4℃包被过夜；弃去孔内的包被液，PBST洗2次，拍干，加封闭液每孔100μl，置37℃封闭2h，PBST洗3次，拍干；②所述兔抗重组PP65pAb的制备：免疫前兔耳缘静脉采血，分离血清，作为免疫血清效价检测的阴性对照；取100‑300μg重组PP65抗原与等体积弗氏完全佐剂混合，振荡混匀制成乳化剂，皮下及皮内多位点免疫兔子；免疫后14‑28天，取90‑170μg重组PP65抗原与等体积弗氏不完全佐剂混合，振荡混匀制成乳化剂，第二次皮下及皮内多位点免疫兔子；第二次免疫后28‑42天，与第二次方法一样再次加强免疫；第三次免疫后第10‑20天，采血分离血清，ELISA检测抗体效价，证明免疫成功后，心脏采血获取免疫血清，饱和硫酸铵沉淀法纯化免疫血清，得到所需兔抗重组HCMVPP65的pAb；③所述标准品为封闭液对倍稀释重组PP65抗原从640ng/ml至10ng/ml共7个标准浓度梯度，即640ng/ml、320ng/ml、160ng/ml、80ng/ml、40ng/ml、20ng/ml和10ng/ml；2）制备待测标本取待测新鲜抗凝血2‑3ml，溶解破坏红细胞，150‑250μl生理盐水悬浮白细胞，或调白细胞浓度为10⁵/ml左右，冰浴环境下超声裂解白细胞释放核内抗原，或反复冻融裂解法释放核内抗原，离心取上清即为制备的待测标本；3）检测人巨细胞病毒PP65抗原a）将标准品各浓度PP65抗原和待测标本每孔50μl加入酶标板中，37℃孵育lh，PBST洗涤5次，拍干；b）加兔抗重组PP65pAb，每孔50μl，37℃孵育1h，PBST洗涤5次，拍干；c）加HRP‑羊抗兔IgG，每孔50μl，37℃孵育1h，PBST洗涤5次，拍干；d）加底物显色液，每孔100μl，室温避光显色15min；e）加终止液，每孔50μl，酶标仪检测并记录OD450值，根据标准曲线，计算待测样本的PP65抗原含量。