一种牛奶中酪蛋白磷酸肽液相检测方法

摘要

一种牛奶中酪蛋白磷酸肽液相检测方法，步骤包括：将待检牛奶加入酪蛋白磷酸肽制成成10～100ppm的酪蛋白磷酸肽分散溶液，脱蛋白后过阳离子交换树脂柱脱钙，将脱钙后所得洗脱液过阳离子交换树脂柱，除杂和富集，将收集液在温度60～70℃，转速为50～60rpm下真空旋转蒸发，过膜后作为液相检测样品；然后进行液相检测，按外标法以峰面积法计算牛奶中添加酪蛋白磷酸肽的浓度。本发明在减少了实验初期试剂、仪器等资金投入的同时，运用相对简单高效的纯化步骤进行操作，实现酪蛋白磷酸肽的分离，保证了定量精度，并有效去除其他蛋白质和脂类等杂志干扰，提高了最终检测的灵敏度，有利于酪蛋白磷酸肽含量相对较低的样品检测。

主权项

一种牛奶中酪蛋白磷酸肽液相检测方法，其特征在于，步骤包括：（1）将待检牛奶置于烧杯中，加入浓度为5 mg/mL的酪蛋白磷酸肽（CPP）标准溶液，混匀，加标成10~100ppm的酪蛋白磷酸肽分散溶液；（2）脱蛋白，方法是取5~10g酪蛋白磷酸肽分散溶液于50mL塑料离心管中，加入5~10g水，混匀后再加入5‰~1.5%三氯乙酸5~10g，漩涡混匀并超声5~15min，然后以4000~4800rpm离心5~15min，离心后将离心管放入65~75℃的水浴锅中水浴5~15min，再以4000~4800rpm离心5~15min，取上清液滤纸过滤后备用；（3）将预先处理好的阳离子交换树脂填料装入层析柱中，装柱体积为3~5mL，用2~3倍柱体积的水洗涤填料，除去树脂中的杂质，关闭活塞；将步骤（2）处理好的样品缓慢地加入层析柱中，打开活塞，使液体缓慢流下，流速为1~2滴每秒；用水做洗脱剂，洗脱体积为1~2倍柱体积，收集洗脱液；（4）将预先处理好的阴离子交换树脂填料装入层析柱中，装柱体积为3~5mL，用2~3倍柱体积的水洗涤填料，除去树脂中的杂质，洗涤完成后、关闭活塞；将步骤（3）收集的洗脱液处理好的样品缓慢地加入层析柱中，打开活塞，使液体缓慢流下，流速为1~2滴每秒；首先用2~3倍柱体积的水洗脱，除去杂质，然后用浓度为0.1~0.4mol/L HCl做洗脱剂，洗脱体积为2~3倍柱体积，收集洗脱液；（5）将收集液转到浓缩瓶中，以浓缩温度为60~70℃，转速为50~60rpm，进行真空旋转蒸发至1~2mL，准确记录浓缩后的体积，过膜后作为液相检测样品；（6）液相检测：色谱柱Diamosil C18(2) 5u，250×4.6mm，流动相A：0.1%三氟乙酸水溶液，流动相B：0.1%三氟乙酸乙腈溶液，流速1mL/min；梯度洗脱程序：从0到45min，流动相B浓度由5%梯度洗脱到35%，洗脱时段中均以流动相A补足余下的百分数，进样量20μL，柱温常温，波长，215nm；（7）按外标法以峰面积法计算牛奶中添加酪蛋白磷酸肽的浓度。