发明名称 芥菜型油菜中花色素合成酶ANS基因和埃塞俄比亚芥中花色素还原酶 BAN 基因共转化促进大肠杆菌产原花色素的方法
摘要 本发明公开了一种采用芥菜型油菜基因ANS和埃塞俄比亚芥基因BAN共转化提高大肠杆菌中原花色素含量的方法。本发明从芥菜型油菜种子的cDNA中克隆花色素合成酶ANS基因和埃塞俄比亚芥种子的cDNA克隆花色素还原酶BAN基因,构建含ANS和BAN基因的原核表达载体pET-ANS-BAN,将ANS和BAN基因同时导入BL21大肠杆菌菌株。转化菌株在的LB液体培养基中,28-38℃,150-250rpm(转/分钟)培养6-12小时候后,再转移到葡萄皮提取物(0.2-0.8g/L)的LB液体培养基中,28-38℃,150-250rpm震荡培养36-54小时后,离心收集菌体,采用DMACA-HCl法测定大肠杆菌所含的原花色素的量。本发明获得的转基因大肠杆菌中原花色素的含量显著提高,最高达到非转化对照菌株的24.2倍。
申请公布号 CN102827861B 申请公布日期 2014.04.30
申请号 CN201210295300.8 申请日期 2012.08.20
申请人 湖南科技大学 发明人 刘丽莉;严明理;向建华;孙婵;尹小明
分类号 C12N15/70(2006.01)I;C12N1/21(2006.01)I;C12R1/19(2006.01)N 主分类号 C12N15/70(2006.01)I
代理机构 张家界市慧诚商标专利事务所 43209 代理人 高红旺
主权项 一种采用芥菜型油菜基因ANS 和埃塞俄比亚芥BAN 共转化提高大肠杆菌中原花色素含量的方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)从芥菜型油菜种子的cDNA中克隆花色素合成酶ANS基因和埃塞俄比亚芥种子的 cDNA中克隆花色素还原酶BAN基因;(2)把ANS 和BAN 基因可操作性地连接于表达调控序列,形成含ANS 和BAN基因的原核表达载体;(3)将ANS和BAN基因同时导入BL21大肠杆菌,转化的单菌落在0.5‑1.0 mL的LB液体培养基中,28‑38℃,150‑250rpm(转/分钟)培养6‑12小时候后,再在含黑色葡萄皮提取物的LB液体培养基中,28‑38℃,150‑250rpm震荡培养36‑54小时后,常温下,10000‑12000g离心10‑20min收集菌体;(4)采用DMACA‑HCl法测定大肠杆菌所含原花色素的量,筛选获得原花色素含量提高的大肠杆菌菌株;所述的黑色葡萄皮提取物提取方法是:将黑色或深红色的葡萄皮用粉碎机粉碎,过1.0 mm 的筛,将用20%‑50%的甲醇(v/v)作为萃取溶剂,葡萄皮量与溶剂用量之比为1∶3‑5(w/w),萃取温度为50℃‑60℃,萃取时间为3‑6h;回收甲醇后的浓缩液在10000‑12000g离心10‑15min,过滤去渣,然后在浓缩液中加入丙酮,浓缩液与丙酮之比为1∶1‑2(v/v),搅拌混匀5‑10min,过滤除去杂质,浓缩液经回收丙酮后,在40℃‑60℃下真空干燥即得葡萄皮提取物。
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