一种农杆菌介导的尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株遗传转化方法

摘要

本发明提供一种农杆菌介导的尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株遗传转化方法，包括以下步骤：（1）尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株分生孢子悬浮液制备；（2）含有外源基因的农杆菌菌液制备；（3）尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株的外源基因转化；（4）尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株转化子的鉴定。本发明利用农杆菌介导的方法，将外源基因转入尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株的基因组中，获得了尖孢镰刀菌西瓜专化型转基因菌株。该方法简单、快捷、重复性好、转化效率高，可用于尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株突变体库构建、寄主抗性筛选、寄主对尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株侵染的防卫反应、以及尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株侵染及致病机理的研究。

主权项

一种农杆菌介导的尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株遗传转化方法，其特征在于包括以下4个步骤：（1）尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株分生孢子悬浮液制备：挑取枯萎病菌尖孢镰刀菌西瓜专化型菌丝，在马铃薯固体培养基上培养7 d后，用培养基A收集并稀释孢子液，调节孢子液浓度至1x10⁶个/mL，得到尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株孢子悬浮液，备用；（2）含有外源基因的农杆菌菌液制备：将携带表达载体pGFP的农杆菌AGL‑1在新鲜的平板A上划线，28℃培养48 h后，挑取单克隆，接种到5mL培养基B中，于25 ℃，220rpm摇培48 h后用紫外分光光度计测OD₆₀₀值，用培养基A稀释，使菌液OD₆₀₀=0.15，然后将菌液稀释液在28℃振荡培养6 h，得到AGL‑1农杆菌菌液，备用；（3）尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株的外源基因转化：1）将步骤（2）中制备的AGL‑1农杆菌菌液和步骤（1）中制备的尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株孢子悬浮液等体积混合，取200 μL混合液均匀涂布于不含抗生素的IM共培养平板上的硝酸纤维素滤膜表面，25 ℃避光共培养48 h；2）共培养48 h后，将滤膜揭下，反铺到培养基C上，25 ℃培养48 h；3）48 h后弃掉硝酸纤维素滤膜，将PDA筛选平板在25 ℃继续培养至生长出转化子；4）用无菌接种环挑取单个转化子接种到PDA筛选平板上进行二次筛选，25 ℃培养，保存得到的转化子，用于阳性鉴定；（4）尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株转化子的鉴定。