检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的活毒抗体试剂盒

摘要

本发明涉及一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的活毒抗体试剂盒，其特征在于：将待检血清用样品稀释液2倍稀释后100ul加入ELISA板中37℃孵育1h，设置阳性对照、阴性对照和空白对照。用洗涤液清洗5次，每次2min；然后加入结合单抗每孔100ul，37℃孵育1h，洗涤液清洗5次，每次2min；然后加入羊抗小鼠IgG-HRP结合物37℃作用1h，洗涤液清洗5次，每次2min；然后加入显色底物溶液，将底物A和底物B以1:1混合，100ul加入ELISA孔中，避光显色15min，加入50ul终止液，测其OD490值。判定结果是这样设定的：抑制率PI=(OD未抑制-OD样品)/OD未抑制*100%，PI>30%对应的样品为阳性，小于则为阴性。该试剂盒方法技术成熟，重复性强，能够有效区分猪繁殖与呼吸综合征病毒活毒和灭活毒抗体，一般研究人员即可完成。

主权项

检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的活毒抗体试剂盒，其特征在于：将96孔ELISA板、样品稀释液、20倍浓缩洗涤液、羊抗小鼠IgG‑HRP结合物、结合单抗、终止液、A底物、B底物、阳性样品、阴性样品、盖板膜分别用的广口瓶加以封装，贴上标签，组装成试剂盒，具体组装方法按以下步骤完成：   第一步：首先对96孔ELISA板进行包被：96空ELISA板上包被有PRRSV Nsp9蛋白，用包被缓冲液将Nsp9蛋白稀释到1.5μg /mL，每孔100μL包被ELISA板，37℃包被1h后用含5%脱脂奶粉的PBS 37℃封闭1h，然后用PBS洗涤5次干燥后用铝箔真空密封备用；   第二步：配制PBST pH7.4的样品稀释液:NaCl 8.0g；KH₂PO₄ 0.2g；Na₂HPO₄ ·12H₂O 2.9g；KCl 0.2g补加二馏水致1000mL加入0.5mL Tween‑20，最后50mL分装；   第三步：配制20倍浓缩洗涤液：NaCl 160.0g；KH₂PO₄ 4g；Na₂HPO₄ ·12H₂O 58g；KCl 4g补加二馏水致1000mL;加入10mL Tween‑20，最后50mL分装；   第四步：将购买的羊抗小鼠IgG‑HRP结合物用 10mL PBST加入2μL羊抗小鼠IgG‑HRP二抗进行稀释，然后加入4%PEG,以25mL分装；第五步：结合单抗的制备：首先根据猪繁殖与呼吸综合征病毒BJ‑4株及HB‑1、SY0608、HN‑HW、HuN4变异毒株的核苷酸序列，利用Primer软件设计合成针对PRRSV Nsp9基因保守区域的特异性引物；用RT‑PCR方法扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒JL/07/SW株Nsp9基因片段，克隆到 pMD18‑ T载体并测序，基因克隆至表达载体pET‑28a(+)，得到重组表达载体pET‑28a‑Nsp9 ，用经鉴定的阳性重组质粒pET‑28a‑Nsp9转化BL21(DE3) 感受态细胞，涂板挑菌，Kan100 mg/mL，阳性菌在涂加100 mg/mL 卡那霉素Kan 100 mg/mL的LB液体培养基中振摇培养过夜后，按1%转接种于含Kan100 mg/mL卡那霉素的LB培养基，37℃振摇培养至OD600nm=0.6即对数生长期，加入终浓度1mmol/L 的IPTG，37℃诱导培养3 h；离心沉淀菌体,超声破碎后经电洗脱得到高纯度的重组Nsp9蛋白，于‑80℃保存备用；然后用重组Nsp9蛋白制备单克隆抗体，具体方法如下：1)、动物免疫  选择6‑8周龄健康Balb/C小鼠以弗氏完全佐剂乳化纯化的PRRSV Nsp9蛋白,每只小鼠腹腔注射100μg,14d后以弗氏不完全佐剂乳化蛋白腹腔注射100μg,最后一次加强免疫时,直接腹腔注射100μg纯化的蛋白,融合前3～4d尾静脉注射50μg 纯化的蛋白；2)、细胞融合  取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0混合于融合管内, 以300g离心10 min, 弃去上清, 振荡细胞, 使两种细胞尽量混合均匀, 然后60s内缓慢滴加预热的PEG‑4000溶液,再缓慢加入无血清的1640培养基终止融合, 静置后再以1 000 r/min离心10 min , 弃去上清后加入HAT培养基,使细胞悬浮并混匀, 于96孔培养板中培养,第14d开始换液并开始检测筛选；3)、杂交瘤细胞的筛选和克隆化   克隆的筛选采用间接ELISA, 用纯化的PRRSV Nsp9蛋白作为包被抗原；对所获阳性杂交瘤细胞的培养上清进行筛选；将ELISA筛选的阳性杂交瘤细胞进行克隆化,将检出的阳性孔再次克隆和亚克隆,直到所有的孔都为阳性；通过三次细胞克隆最终获得杂交瘤细胞株2D6；4)、腹水的制备　0.5 mL的高压灭菌的石蜡油注射到小鼠腹腔,7d后注入106 个杂交瘤细胞于小鼠腹腔,一周后抽取腹水,将收集好的腹水置37℃ 24h ,随后置4℃过夜, 第二天将腹水离心, 上清56℃灭活30 min即可；5)、单克隆抗体的纯化　用4倍体积醋酸缓冲液稀释腹水,调至pH4.5 ,缓慢滴加3.3 %的正辛酸,搅拌30 min ,离心取上清,加入1/10体积的10倍PBS ,调至pH7.4 ,4℃预冷后,用45 %饱和硫酸铵沉淀,离心后取沉淀,用PBS稀释后移入透析袋,在50倍体积PBS中透析,透析期间多次换液,透析结束后,紫外分光光度计280 nm 测定蛋白浓度并分装冻存；6)、 抗猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp9蛋白单克隆抗体的特性鉴定　（1）、腹水效价测定  间接ELISA方法测定,细胞培养上清与腹水分别从10倍和100倍开始做梯度稀释,同时分别以SP2/0 细胞培养上清和腹水做同等稀释度作为对照；通过检测得知2D6单抗的腹水效价为6.4×10⁵；（2）、猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp9蛋白单克隆抗体IgG亚类鉴定  按小鼠mAb IgG亚类检测试剂盒的说明书进行；具体方法是将纯化的每株单克隆抗体1000倍稀释后包被酶标板,每孔100μL ,37℃孵育1 h ,洗涤后每孔加入1 000倍稀释的抗体亚类试剂100μL ,37℃孵育1 h ,洗涤3遍；然后加入羊抗小鼠IgG酶标二抗, 37℃孵育1 h ,洗涤后加入底物显色,确定单克隆抗体的亚类为IgG2a.（3）、杂交瘤细胞株染色体的分析  采用秋水仙素法对杂交瘤细胞株进行染色体分析，结果显示2D6杂交瘤细胞的染色体数目为101条；（4）、猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体特异性鉴定  将所获单克隆抗体分别与猪伪狂犬病毒、猪流感病毒、猪细小病毒进行间接ELISA,检测所得知制备的单克隆抗体与其它猪病毒病均无交叉反应性；将以上纯化单抗2D6 以80000倍稀释于PBS中加入4%PEG，25mL分装；第六步：配制终止液：2mol/L H₂SO₄  浓硫酸44.5mL，双蒸水355.5mL，10mL分装；第七步：配制A底物：TMB 200mg，无水乙醇100mL加双蒸水至1000mL，10mL分装；第八步：配制0.1mL/L柠檬酸‑0.2mL/L磷酸氢二纳，pH5.0‑5.4 的B底物：Na₂HPO₄ 14.60g，柠檬酸9.33g，0.75%过氧化氢6.4ml，加三蒸水至1000mL，调至pH5.0‑5.43，10mL分装；第九步：配制阳性样品：将标准PRRSV阳性血清1:5稀释于样品稀释液中，1mL分装；第十步：配制阴性样品：将经检测PRRSV阴性血清1:5稀释于样品稀释液中，1mL分装。