一种组织工程化房室结及其构建方法与应用

摘要

本发明涉及生物医学工程技术领域，目前国内、外尚无构建组织工程化房室结的研究报道。本发明提供了一种利用胶原海绵和骨髓间充质干细胞诱导获得的心脏起搏细胞和传导细胞构建组织工程化房室结的方法。本发明采用与窦房结细胞共培养诱导骨髓间充质干细胞成为起搏细胞，与心耳肌细胞共培养的方法诱导骨髓间充质干细胞成为心脏传导细胞。将此两种细胞作为种子细胞，胶原海绵作为支架，在体外构建具有起搏特性及心电传导特性的组织工程化房室结。本发明经动物实验将构建成功的组织工程化房室结移植治疗房室传导阻滞取得良好的治疗效果。本发明获取了一种具有心电传导特性、可用于治疗移植的组织工程化房室结，为治疗心脏房室传导阻滞所致心律失常疾病带来了希望。

主权项

一种组织工程化房室结的构建方法，包括如下步骤：A、与窦房结细胞共培养诱导骨髓间充质干细胞成为起搏细胞抽取骨髓接种培养获得骨髓间充质干细胞，取窦房结组织进行原代培养获得窦房结细胞，然后利用细胞培养池将窦房结细胞与骨髓间充质干细胞共培养，并且在培养液中添加10mmol/L的5‑氮杂胞苷结合10^‑8M的内皮素‑1，培养时间6‑7天，诱导骨髓间充质干细胞为心脏起搏细胞；B、与心耳肌细胞共培养诱导骨髓间充质干细胞成为心脏传导细胞抽取骨髓接种培养获得骨髓间充质干细胞，取心耳部位组织进行原代培养获得心耳肌细胞，然后利用细胞培养池将心耳肌细胞与骨髓间充质干细胞共培养，并且施加旁分泌因子内皮素‑1和神经调节蛋白‑1，浓度均为1×10^‑8M‑1.5×10^‑8M，培养时间6‑7天，诱导骨髓间充质干细胞成为心脏传导细胞；C、利用胶原海绵和诱导获得的心脏起搏细胞和传导细胞构建组织工程化房室结将胶原海绵剪成1.5×1.0×0.2cm大小，用钴⁶⁰照射12小时以上消毒备用；分别取诱导获得的心脏起搏细胞和传导细胞，加0.25%胰酶1ml，于37℃、5%CO₂培养箱中消化1‑2分钟，倒置相差显微镜下观察，细胞胞体回缩呈圆形，加含10%FBS的DMEM/F12培养基1ml终止消化，用玻璃滴管吹打成单细胞悬液，1200转低速离心5分钟，弃去上清液，加入含血清的培养液，用玻璃滴管吹打成单细胞悬液，调整细胞密度为1×10⁶个/ml，将两种细胞按1:1～1:2混合制成混合细胞悬液，置4℃冰箱保存备用；于6孔培养板底滴加50μl的细胞悬液，将胶原海绵置于细胞悬液中，待海绵将细胞悬液吸收后再向海绵表面滴加50μl的细胞悬液，置于37℃，含5%CO₂的培养箱中孵育1小时，再向培养孔中加入2ml含10%FBS的新鲜培养液，继续置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养两周，每两天换一次液。