一种大量制备双功能域β-折叠桶植酸酶二体的方法

摘要

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种大量制备双功能域β-折叠桶植酸酶（二体）的方法。根据本发明的方法，首先利用PCR反应从phyH基因中获得双功能域β-折叠桶植酸酶基因，在大肠杆菌中的表达，变复性得到有活性的酶溶液，再分离纯化得到双功能域β-折叠桶植酸酶二体，得到的二体酶活性和蛋白量都得到显著的提高。

主权项

一种大量制备双功能域β‑折叠桶植酸酶二体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：（1）在原核生物中表达氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的双功能域β‑折叠桶植酸酶，表达的目的蛋白以包涵体的形式存在于沉淀中；（2）包涵体洗涤用洗涤缓冲液洗涤沉淀；（3）包涵体的溶解将洗涤干净的沉淀溶于变性缓冲液中，所述变性液的配方为：8M尿素，50mmol/LTris‑Cl，pH8.0，离心后弃去沉淀保留上清液，得到较纯净的包涵体溶液；（3）重组蛋白梯度透析复性将溶解在8M尿素中的包涵体溶液稀释为1mg/ml，先用复性缓冲液透析，时间为12个小时，透析期间要用搅拌子进行低速搅拌，再更换复性缓冲液，逐步降低使用的尿素含量：4mol/L，2mol/L，1mol/L,0mol/L，复性缓冲液中其他成分均不改变，得到了具有生物酶活性的蛋白溶液，其中所述复性缓冲液的配方为：50mmol/LTris‑HCl，6mol/L尿素，1mmol/L氯化钙，pH8.0。