一种结核分枝杆菌耐多药检测方法

摘要

本发明涉及一种结核分枝杆菌耐多药检测方法。目的是提供的方法应能同时测定结核分枝杆菌对异烟肼和利福平的耐药性，具有特异性与灵敏度较高、检测快速以及操作简便的特点。技术方案是：一种结核分枝杆菌耐多药检测方法，其步骤是：A、建立MTB临床菌株和标准菌株H37Rv的PCR模板；B、设计与异烟肼和利福平耐药密切相关katG、inhA和rpoB基因片段的三对引物，同时对临床菌株的katG、inhA和rpoB基因进行mPCR扩增；并对临床菌株和标准菌株H37Rv的katG、inhA和rpoB基因分别进行PCR扩增；C、采用单链构象多态性检测方法同时检测临床菌株耐INH和RFP相关的3个基因的突变情况。

主权项

一种非诊断目的的结核分枝杆菌耐多药检测使用的katG、inhA和rpoB基因片段PCR扩增方法，其步骤是：A、建立MTB临床菌株和H₃₇Rv标准菌株的PCR模板；B、设计与异烟肼和利福平耐药密切相关katG、inhA和rpoB基因片段的三对引物，对临床菌株的katG、inhA和rpoB基因进行mPCR扩增；并对临床菌株和H₃₇Rv标准菌株的katG、inhA和rpoB基因分别进行PCR扩增；C、采用单链构象多态性检测方法同时检测临床菌株耐INH和RFP相关的3个基因的突变情况；其特征在于：所述步骤B中的PCR引物是：扩增katG基因的上、下游引物分别为5’‑AAG GAA GCC ACC TGG CTC GGC‑3’以及5’‑GCC GAA CGG GTC CGG GAT GGT‑3’，扩增产物预期的大小为510bp；扩增inhA基因的上、下游引物分别为5’‑GGC ATC CAC ATC TCG GCG‑3’以及5’‑CAG CGC GCA CAC CGT CTT GGC‑3’，扩增产物预期的大小为381bp；扩增rpoB基因的上、下游引物分别为5’‑ACA TCC GGC CGG TGG TCG CCG‑3’以及5’‑TTT CGA TCG GGC ACA TCC GGC‑3’，扩增产物预期的大小为207bp；所述mPCR扩增的反应体系为：PCR总体积100μL，内含2.5mol/L dNTP、katG、inhA和rpoB基因的各自上、下游引物250mmol/L、2.5U Ex‑Taq DNA聚合酶、2μL模板、pH8.3的1×PCR缓冲液；所述mPCR扩增的参数为：94℃4min；94℃30s、52℃30s、72℃45s，循环35轮；72℃5min；采用1μg/mL溴乙锭预染2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物；所述单链构象多态性检测方法是：将上述mPCR产物以及结核分枝杆菌H₃₇Rv标准菌株katG、inhA和rpoB基因的PCR产物各10μL分别与等体积变性剂混合，沸水浴5min后冰浴2min，5000r/min4℃离心2min，取水相加入8%非变性聚丙烯酰胺凝胶上样孔，13℃400V电泳5min后120V电泳10h，然后取胶板进行银染法染色，观察结果；若单链位置与H37Rv标准菌株单链位置不同，称为运动变位，判定为基因突变；所述PCR扩增的反应体系中只加katG、inhA或rpoB基因的各自上、下游引物250mmol/L，反应体系其它成分以及PCR参数与mPCR相同。