一种同步检测三种水稻病毒的方法

摘要

本发明涉及一种简单快速同步检测三种水稻病毒的方法，应用一套病毒特异性引物以待测样品总RNA为模板进行一步RT-PCR扩增，该引物共有6条，分别为DRS-1、DRS-2、DRB-1、DRB-2、DSR-1以及DSR-2，它们的基因序列如序列表所示，最后通过凝胶电泳条带以判断水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)、水稻条纹病毒(RSV)以及南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)的侵染状况。发明有益的效果是：本发明针对生产实际，发展建立了一种快速、准确、灵敏且同步检测这3种重要水稻病毒的方法，并成功应用于单头飞虱以及田间样品的检测和诊断，为水稻黑条矮缩病、条纹病、南方黑条矮缩病的准确诊断、预测预报和科学防控提供了技术支撑。

主权项

一种同步检测三种水稻病毒的方法，其特征是：该检测方法应用一套病毒特异性引物以待测样品总RNA为模板进行一步RT‑PCR扩增，该引物共有6条，分别为DRS‑1、DRS‑2、DRB‑1、DRB‑2、DSR‑1以及DSR‑2，它们的基因序列如序列表所示，最后通过凝胶电泳条带判断水稻黑条矮缩病毒（RBSDV）、水稻条纹病毒（RSV）以及南方水稻黑条矮缩病毒（SRBSDV）的侵染状况，具体包括以下步骤：1）引物设计：通过比对分析RBSDV、RSV以及SRBSDV外壳蛋白的基因，获得3种病毒种内保守种间呈多态性的区域，设计针对3种水稻病毒的6条特异性引物；2）样品总RNA提取：将待测样品置于1.5mL离心管中，加入TRIzol试剂，提取总RNA保存于‑80℃冰箱中备用；3）扩增反应：采用One Step RT‑PCR Kit以样品总RNA提取物为模板进行扩增，反应总体积50μL，内含样品总RNA抽提物5μL，其他各组分参照试剂盒说明，包括2×反应缓冲液25μL，6条引物各1μL，酶混合物2μL，再添加无RNase的ddH2O至总体积50μL，反应程序为50℃反转录30min；94℃预变性2min；94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸30～60s，30个循环；72℃延伸10min；4）电泳分析：取扩增产物5μL，点样至1.2％的琼脂糖凝胶上样孔中，以DL2000DNA标准分子量作为参照，在120伏的电压下于1×TAE电泳缓冲液中电泳30～60min，EB染色后在紫外灯下观察，记录并分析与预期片断大小的一致性。