发明名称 |
一种重组肝靶向干扰素的制备工艺 |
摘要 |
本发明公开了一种重组肝靶向干扰素的制备工艺。本发明对整合有重组肝靶向干扰素基因的原核工程菌发酵条件进行优化,然后破菌提取包涵体、洗涤、变性溶解、梯度透析复性、重组Enterokinase酶切、HisTrap™HP柱和HiTrap™HeparinHP柱组合纯化,制备得到药用重组肝靶向干扰素。本发明通过变性、透析复性后得到的融合蛋白Trx-His-IFN-CSP的纯度可达到95%以上,无需融合蛋白的过柱纯化过程,减少处理步骤中可能的污染与损失;另外,本发明将标签蛋白切除后得到的重组肝靶向干扰素完全忠实于原始设计,有助于减少未知的用药风险;最后,通过肝素亲和层析再次纯化,无需去内毒素过程,简化了工艺,减少了损失。 |
申请公布号 |
CN102925519B |
申请公布日期 |
2014.04.16 |
申请号 |
CN201210456157.6 |
申请日期 |
2012.11.14 |
申请人 |
广东药学院 |
发明人 |
朱家勇;卢雪梅;黄演婷;金小宝;汪洁 |
分类号 |
C12P21/00(2006.01)I;C07K1/22(2006.01)I;C07K1/14(2006.01)I |
主分类号 |
C12P21/00(2006.01)I |
代理机构 |
广州粤高专利商标代理有限公司 44102 |
代理人 |
任重 |
主权项 |
1.一种重组肝靶向干扰素的制备方法,其特征在于包括如下步骤:(1)将含有重组肝靶向干扰素融合蛋白基因的原核工程菌进行发酵;(2)提取包涵体;(3)用洗涤液洗涤包涵体;(4)变性:用溶解液溶解洗涤后的包涵体获得包涵体溶出液;(5)复性:采用对倍稀释加梯度透析的方法去除变性剂;(6)重组Enterokinase酶切:用1.0U的重组Enterokinase酶酶切5天;(7)HisTrapHP柱和HiTrapHeparinHP柱组合纯化:将酶切产物收集之后所得的溶液过预先使用含有10mM咪唑、50mMTris-HCl、pH8.0的缓冲体系平衡的HisTrapHP纯化柱,收集穿透液,用含500mM咪唑、pH8.0的50mMTris-HCl洗脱柱子上的标签蛋白和酶切的碎蛋白,洗脱总体积为柱床的5倍;将HisTrapHP纯化产物收集所得的溶液过预先使用含有0.1M氯化钠、50mMTris-HCl、pH8.0的缓冲体系平衡的HiTrapHeparinHP柱,用0.2M氯化钠冲洗杂蛋白,再用0.5M氯化钠洗脱重组肝靶向干扰素;步骤(3)中所述洗涤液为含有2%脱氧胆酸钠、2M尿素、5mMEDTA、50mMTris-HCl的缓冲液;步骤(4)中所述溶解液为含有6M盐酸胍、2.5mMDTT、5mMEDTA、50mMTris-HCl、pH8.0的缓冲液;步骤(5)中所述对倍稀释是采用含有4M盐酸胍、2.5mMDTT、5%甘油、100mM精氨酸、50mMTris-HCl、pH8.0的稀释液,稀释至蛋白浓度为100ng/ml;步骤(5)中所述梯度透析是采用含0.5~3M盐酸胍、0.2mMMGSH、2mMGSH、50mMTris-HCl、pH8.0的缓冲液对包涵体稀释液进行梯度透析,透析外液的换液间隔最少5小时。 |
地址 |
510006 广东省广州市大学城外环东路280号 |