利用DArT标记技术分析三疣梭子蟹遗传多样性的方法

摘要

本发明公开了利用DArT标记技术分析三疣梭子蟹遗传多样性的方法，特点是包括三疣梭子蟹基因组代表性DNA片段文库构建的步骤；基因组代表性DNA芯片点制及在芯片上设置一系列阳性和阴性对照的步骤；提取不同地理种群三疣梭子蟹的DNA分别与基因组代表性DNA芯片杂交并清洗的步骤；最后杂交后采用芯片扫描仪进行扫描，并用LuxScan3.0软件提取数据，计算获得多态性效率、多态信息含量和遗传分型图谱，优点是可获得稳定并明确的遗传分型图谱，可应用于三疣梭子蟹遗传多态性检测、野生群体和家系识别、遗传图谱和指纹图谱构建等领域，具低成本、高效、稳定、准确的优点。

主权项

1.一种利用DArT标记技术分析三疣梭子蟹遗传多样性的方法，其特征在于包括以下步骤：（1）三疣梭子蟹基因组代表性DNA片段文库构建提取不同地理种群三疣梭子蟹的DNA并等量混合，将混合基因DNA采用限制性内切酶消化后，进行接头连接，连接产物作为模板进行后续PCR扩增，扩增产物纯化后，克隆至载体pMD19-T，转化大肠杆菌TOP10F’并涂布于含氨苄青霉素和X-gal的LB培养基上得到基因组代表性DNA文库；（2）基因组代表性DNA芯片点制从基因组代表性DNA文库中随机挑选单菌落，采用质粒载体上的通用引物M13F-47和M13R-48对插入的DNA片段进行PCR扩增，扩增产物用异丙醇沉淀后，采用微阵列芯片点样仪进行芯片点制，同时在芯片上设置一系列阳性和阴性对照；（3）芯片杂交和清洗提取不同地理种群三疣梭子蟹的DNA，分别采用限制性内切酶消化后，进行接头连接，连接产物作为模板进行后续PCR扩增，扩增产物用异丙醇沉淀后，加入试剂盒中进行Cy3荧光标记，于37℃孵育10min后，加入dNTPs0.4μL，再于37℃孵育30min，加入0.1μLpH8.0的EDTA终止反应，得到Cy3标记反应产物；其中酶切、接头连接及PCR扩增的具体过程同上述步骤（1）；采用pMD19-T载体多克隆位点片段为参考DNA并进行Cy5荧光标记，得到Cy5标记反应产物；将Cy3标记反应产物和Cy5标记反应产物各5.5μL等量混合后，再加入1μL的浓度为10g/L的鲑鱼精DNA和50μLExpressHyb杂交液混合后，96℃变性3min，冰浴骤冷1min，得到Cy3-Cy5标记产物；将步骤（2）得到的基因组代表性DNA芯片在紫外交联仪中250毫交交联备用，然后将基因组代表性DNA芯片与Cy3-Cy5标记产物在晶芯杂交仪中进行杂交反应，于65℃孵育过夜，杂交后先用0.3×SSC，0.1%SDS各清洗一次，再用0.06×SSC清洗两次，离心甩干；（4）数据采集和分析杂交后采用芯片扫描仪进行扫描，并用LuxScan3.0软件提取数据，若对应的参考DNA杂交荧光强度较弱，则属于坏点，弃之；质量符合条件的探针，转换成0或1标记矩阵，计算获得多态性效率、多态信息含量和遗传分型图谱。