一株灰树花菌株及利用该菌株进行液体发酵联产漆酶和β-葡聚糖的方法

摘要

本发明属于生物工程技术领域，提供了一株高产漆酶的灰树花菌株及利用该菌株进行液体发酵联产β-葡聚糖和漆酶的方法。本发明所涉及的生产菌株为灰树花（Grifolafrondosa），微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCCNo.1709。利用该菌株通过液体发酵、固液分离、超滤浓缩、干燥等步骤生产漆酶,同时，以发酵菌丝体为原料经热水提取、冷碱提取、热碱提取、中和、离心、超滤脱盐浓缩、干燥等过程生产β-葡聚糖。该菌株发酵周期短，漆酶酶活水平高，且菌丝体中β-葡聚糖含量高，达到漆酶与灰树花水溶性β-葡聚糖联产，适合工业化生产。

主权项

一种生产漆酶和β‑葡聚糖的方法，其特征在于：包括灰树花发酵及漆酶提取分离和β‑葡聚糖提取分离的步骤，在漆酶的发酵过程中应用漆酶产生过程的诱导和积累过程的诱导工序：所述的漆酶产生过程的诱导和积累过程的诱导工序具体步骤如下：A.诱导因子筛选：从漆酶可以作用的底物、菌株发酵过程所需的生长因子、酶系的调控三个方面筛选诱导因子，诱导因子选自含特定金属离子的盐或生长因子或漆酶底物；B.诱导因子使用方法：将酶系调控所需的含特定金属离子的盐、特定生长因子及漆酶底物加入培养基中用于调控细胞内酶系；C.发酵控制：首先用正常浓度的碳源使菌体生长，进入生产期后再陆续补加碳、氮源，通过不断补料把菌体维持在生长状态，从而提高漆酶的产率；所述诱导因子中的特定金属离子选自含钙离子或镁离子或铜离子或锌离子或钴离子或锰离子中的一种或几种盐的混合物；生长因子选自B族维生素；底物选自愈创木酚、木素、木屑、小麦秸秆等中的一种或几种混合物；其整个工艺具体步骤如下：（1）灰树花液体发酵：A.斜面菌种活化；B.液体摇瓶种子制备；C.诱导产酶的液体发酵培养基制备；D.发酵：菌种活化后，经液体发酵扩繁种子菌悬液，再利用液体深层发酵方法生产得到发酵液；其中发酵过程具体为：将液体种子以2‑10%（v/v）的接种量接到含有诱导因子的液体发酵培养基中，初始还原糖浓度为18.26mg/mL，26℃培养72h，流加10‑40%（v/w）的碳源及10‑20%（v/w）的氮源，控制发酵液还原糖在0.5‑2mg/mL水平，氨基氮在100‑500mg/L之间，同时控制代谢过程的pH在5.0‑6.5之间，共培养120‑240h；经上述工艺发酵后，漆酶发酵水平达到500U/mL以上；（2）漆酶提取分离和纯化步骤：A.发酵液预处理：调整上步发酵液pH值6‑8，固液分离；固体菌丝做提取灰树花水溶性β‑葡聚糖使用；B.膜分离：固液分离后的发酵液采用孔径0.1‑0.5μm的膜微滤，澄清液用2‑6KD的超滤膜浓缩，得到2‑5wt%的漆酶浓缩液，添加保护剂，混合均匀后干燥；C.干燥：进风温度180‑260℃、出风温度60‑90℃的条件下，将加入保护剂的浓缩液喷雾干燥，得到漆酶产品；（3）灰树花β‑葡聚糖的提取分离和纯化步骤如下：A.干燥粉碎：将上述发酵的菌丝体经固液分离后，菌丝体干燥、粉碎，得到灰树花菌丝粉；B.水提：菌丝粉加入10‑30（w/w）倍质量的水提取，提取温度80‑140℃，提取时间0.5‑2h，提取次数1‑2次，经固液分离后，得到固形物Ⅰ，合并提取液，经减压浓缩后，经喷雾干燥，得到灰树花提取物；C.碱提：向水处理所得固形物Ⅰ中加入氢氧化钠溶液，加入的氢氧化钠溶液体积为固形物Ⅰ体积的10‑30倍（v/v），氢氧化钠溶液浓度为4%‑12%（w/v），处理温度为80‑90℃，搅拌反应时间1h，提取1‑2次；碱提取后所得清液用乙酸中和，中和时，控制清液的PH范围为5.0‑6.0，离心，得到清液，沉淀经处理用于饲料加工；D.脱盐：碱提后的清液采用孔径0.1‑0.5μm的微滤膜过滤，澄清液再用6KD的超滤膜脱盐；E.酶解：脱盐后的清液，用去离子水调整多糖浓度1‑2wt%，调整pH值在7.5‑8.5，添加0.01‑0.1%（w/v）的蛋白酶在50‑60℃的条件下，酶解2‑4h，100℃灭活10min；F.浓缩、干燥：酶解液采用孔径0.1‑0.5μm的膜微滤，澄清液用6KD的超滤膜浓缩，然后喷雾干燥，喷雾干燥条件：进风温度180‑260℃、出风温度60‑90℃的条件下干燥，得到水溶性灰树花β‑葡聚糖；其中所述的液体种子培养基组成，按重量份计（w/w）为：马铃薯1%，酵母浸粉0.15%，麸皮2%，葡萄糖2%，玉米粉0.5%，蛋白胨0.3%，硫酸镁0.1%，磷酸二氢钾0.05%，加水至1000mL；灭菌条件为121℃，0.15Mpa灭菌30min；所述的液体培养基组成，按重量份计（w/w）为：马铃薯1%，愈创木酚0.1%，酵母浸粉0.15%，麸皮2%，葡萄糖2%，玉米粉0.5%，蛋白胨0.3%，硫酸镁0.1%，硫酸铜0.02%，磷酸二氢钾0.05%,加水至1000mL；灭菌条件为121℃，0.15Mpa灭菌30min；所述的灰树花菌株，保藏号为CGMCC No.1709。