一种石斛原球茎包埋玻璃化法超低温保存方法

摘要

本发明公开了一种石斛原球茎包埋玻璃化法超低温保存方法：取幼嫩石斛原球茎在预培养基中，4℃下黑暗培养7天后分别用褐藻酸钠包埋液和钙离子包埋液进行包埋，将石斛原球茎的包埋颗粒置于质量浓度60%的PVS2混合溶液中，0℃下处理30~60min，移去PVS2混合溶液，加入PVS2溶液，0℃下平衡2~3h，将装载后的包埋颗粒迅速置于液氮中保存在冷冻管中；使用时，将液氮中保存的冷冻管取出，解冻后的包埋颗粒置于MS基本培养基中可恢复培养，实现所述石斛种子的超低温保存；本发明可以有效降低玻璃化法带来的二甲基亚砜对组织的毒害，能较好的保存石斛种质资源，减少多次继代培养过程中产生的突变和生长活力下降等问题。

主权项

一种石斛原球茎包埋玻璃化法超低温保存方法，其特征在于：所述方法为：（1）预处理：取直径为3～4mm的幼嫩石斛原球茎，置于预培养基中，4℃下黑暗培养7天，获得预培养后的石斛原球茎；所述预培养基为添加终浓度4g/L琼脂粉，然后再含有终浓度0.4mol/L山梨醇或蔗糖的1/2MS培养液；（2）两步法包埋：将步骤（1）预培养后的石斛原球茎在褐藻酸钠包埋液中室温下浸泡20min，再移取石斛原球茎和褐藻酸钠包埋液的混合液置于钙离子包埋液中室温下浸泡2～3h，获得石斛原球茎的包埋颗粒；所述褐藻酸钠包埋液为添加终浓度20g/L褐藻酸钠、终浓度2mol/L甘油和质量终浓度4～5%高渗溶质a的MS基本培养液，所述高渗溶质a为蔗糖或山梨醇；所述钙离子包埋液为添加终浓度0.3mol/L氯化钙和质量终浓度4～5%高渗溶质b的1/2MS培养液，所述高渗溶质b为蔗糖或山梨醇；（3）两步法装载：将步骤（2）石斛原球茎的包埋颗粒置于质量浓度60%的PVS2混合溶液中，0℃下处理30～60min，移去PVS2混合溶液，加入PVS2溶液，再在0℃下平衡2～3h，获得装载后的包埋颗粒；所述质量浓度60%的PVS2混合溶液为PVS2溶液与MS基本培养液以体积比3:2的混合溶液，所述PVS2溶液的质量终浓度组成为：0.4mol/L蔗糖、体积终浓度30%甘油、体积终浓度15%二甲基亚砜和体积终浓度15%乙二醇，溶剂为水；（4）冷冻：将步骤（3）获得装载后的包埋颗粒保存在冷冻管中迅速置于液氮中；使用时，将液氮中保存的冷冻管取出，在40℃水浴中解冻，取出包埋颗粒，并用25℃预热的去离子水冲洗包埋颗粒表面，再在高渗MS液体培养基中润洗3次，获得解冻后的包埋颗粒，所述高渗MS液体培养基为添加质量终浓度3.5%蔗糖或质量终浓度4%山梨醇的MS基本培养基；解冻后的包埋颗粒置于MS基本培养基中可恢复培养，实现所述石斛原球茎的超低 温保存。