一株产丁二酸基因工程菌及其发酵生产丁二酸的方法

摘要

本发明属于生物工程技术领域，涉及一株产丁二酸基因工程菌及其发酵生产丁二酸的方法。本发明的产丁二酸基因工程菌菌株分类命名为大肠埃希氏菌（Escherichia coli）BA306，其保藏编号为CCTCC NO：M2012103。其构建过程主要包括失活或敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因和磷酸转运系统中的ptsG基因，并过量共表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和烟酸磷酸核糖转移酶，使重组大肠杆菌能够高效利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖及果糖等单糖，同时高效利用各种比例混合糖以及纤维素水解液生长，大幅度提高了丁二酸的合成效率。其发酵方法采用两阶段发酵方式，有氧阶段提高生物量，厌氧阶段发酵产酸。

主权项

一株产丁二酸基因工程菌菌株BA306，其分类命名为大肠埃希氏菌（Escherichia coli），其保藏号编号为CCTCC NO：M2012103；以缺乏乳酸脱氢酶基因，丙酮酸甲酸裂解酶基因活性的菌株大肠杆菌E.coliNZN111为出发菌株，利用同源重组技术敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因和磷酸转移酶系统的ptsG基因，并过量共表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和烟酸磷酸核糖转移酶后，得到大肠埃希氏菌 BA306；具体构建步骤如下：（1） 以缺乏乳酸脱氢酶基因，丙酮酸甲酸裂解酶基因活性的E.coli NZN111菌株为出发菌株，敲除其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因和磷酸转移酶系统的ptsG基因，得到同时缺乏ldhA、pflB、ppc和ptsG的感受态菌株；（2）纯化扩增出磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶基因，构建得到过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的表达质粒；（3）纯化扩增出烟酸磷酸核糖转移酶基因，连接到步骤（2）所述的表达质粒上，构建得到过量共表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和烟酸磷酸核糖转移酶的表达质粒；（4）将步骤（3）所述的质粒导入步骤（1）得到的感受态菌株，获得阳性转化子；（5）利用步骤（4）的阳性转化子过量共表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和烟酸磷酸核糖转移酶，恢复其在厌氧条件下代谢，得到大肠埃希氏菌 BA306。