气相色谱-质谱检测细胞内外液中糖的方法

摘要

本发明涉及一种气相色谱-质谱检测细胞内外液中糖的方法，属于生物化学检验测定技术领域。本发明检测方法步骤包括：（1）取发酵液，高速离心，分别收集细胞和细胞外液；（2）细胞内代谢物样品制备，将收集的菌体用生理盐水清洗，冷甲醇溶解后超声破碎，低温萃取，离心收集萃取上清液，加入内标物，低温真空烘干；（3）细胞外液样品制备，用乙腈除去胞外液中蛋白，涡旋振荡，再离心收集上清，加入内标物，低温真空烘干；（4）样品衍生，加入糖衍生剂、氨基酸衍生剂；（5）气相色谱-质谱分析和数据采集。本发明具有样品处理简单，操作简便，检测时间短，灵敏度高，检测结果重复性高，可实现多个样品制备等优点。

主权项

一种气相色谱‑质谱检测细胞内外液中糖的方法，其特征在于，检测方法步骤包括：（1）取发酵液，高速离心，分别收集菌体和上清液Ⅰ；（2）细胞内代谢物样品制备：取步骤1）得到的菌体，用生理盐水清洗2~3次，冷甲醇溶解后超声破碎至细胞裂解，得到裂解液，低温萃取裂解液，离心收集50~200ul萃取后裂解上清液Ⅱ，加入内标物核糖醇溶液，裂解上清液Ⅱ体积与内标物核糖醇重量比例为50~200ul:20μg，室温真空烘干，得到细胞内代谢物样品Ⅰ；（3）细胞外液样品制备：取60~350ul步骤1）得到的上清液Ⅰ，在清液Ⅰ中加入乙腈除去蛋白，上清液Ⅰ与乙腈体积比为1:0.5~1.5，涡旋振荡，再离心收集上清液Ⅲ，加入内标物核糖醇溶液，上清液Ⅲ体积与内标物核糖醇重量比例为50~300ul：20μg，室温真空烘干，得到细胞外液样品Ⅱ；（4）样品衍生：在步骤2）和步骤3）得到的样品Ⅰ和样品Ⅱ中，分别加入50~150ul糖衍生剂，恒温放置1.5~4h，再分别加入50~150ul氨基酸衍生剂，恒温放置过夜，衍生完毕，分别离心衍生后的样品Ⅰ和样品Ⅱ，对应收集各自上清得到待测胞内样品Ⅰ和待测胞外样品Ⅱ；（5）利用气相色谱‑质谱对步骤4）得到的待测胞内样品Ⅰ和待测胞外样品Ⅱ，分别进行分析和数据采集。