一种保护细胞连接的深低温保存方法

摘要

本发明公开了一种保护细胞连接的深低温保存方法，其中，包括如下步骤：a.MDCK细胞培养的步骤；b.将步骤a所得MDCK细胞分配为正常对照组、深低温保存组、海藻糖组、Hsp70高表达组和Hsp70+海藻糖组；c.将步骤b中的正常对照组、深低温保存组、海藻糖组、分别做滤器培养；Hsp70高表达组做滤器培养和基因转染，Hsp70+海藻糖组做滤器培养和基因转染；d.将正常对照组、深低温保存组、海藻糖组、Hsp70高表达组和Hsp70+海藻糖组进行深低温保存；e.细胞生长及形态学观察(培养细胞显微镜观察、HE染色)；f.细胞活率测定；g.细胞连接形态与结构观察与分析；h.荧光黄实验。本发明工艺简单，使用方便，组织和器官在深低温保存后细胞连接的结构和功能能够保持其完整性，能够有效避免细胞连接受损。

主权项

一种保护细胞连接的深低温保存方法，其特征在于，按照如下步骤操作：组织或器官的Hsp70高表达：热休克，TEB样本培养皿置于加热板上，并加温到41℃，保持15min，恢复37℃条件，继续培养120min；深低温保存：第1步：将TEB缓慢移入冷冻瓶内，添加预冷到4℃的1号CPM，保持4℃冷平衡10分钟；第2步：吸去1号CPM，再向瓶内添加预冷到4℃的2号CPM，再次4℃冷平衡10分钟；第3步：将冷冻瓶移入程序控制降温仪内，以1.0℃／分钟速率降温至‑80℃，然后将细胞缓慢浸没液氮中保存，直至复温；复温时：液氮中取出冷冻瓶，液氮蒸发后将冷冻瓶置于37℃水浴箱内复温，待CPM冰球融化后，吸去CPM，加入培养液洗涤2次；所述1号CPM为：5％Me2SO+DMEM+0.5M海藻糖；所述2号CPM为：10％Me2SO+DMEM+0.5M海藻糖；所述TEB样本为，用股骨头制取脱钙骨基质，有空体积约80％，平均孔径330±33.6微米，分离成骨化诱导的BMSC种植支架上，37℃培养4小时，让细胞附着，然后将支架移入24孔板，加入成骨诱导培养液继续培养，每2‑3天换液一次。