一种香菇241-4菌种的SSR标记指纹图谱与应用

摘要

本发明涉及一种香菇241-4菌种的SSR标记指纹图谱与应用，该指纹图谱由7对基于香菇基因组序列开发的SSR标记的特异等位片段组合而成。应用包括：对香菇菌种进行SSR标记扩增，将得到的带型与指纹图谱对照，与该指纹图谱一致即为香菇241-4菌种。本发明与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短、准确性高、可重复性好的优点，在收集的我国25个国审的香菇主栽菌种中具有香菇241-4菌种的专一性。

主权项

一种鉴定香菇241‑4菌种的方法，其具体步骤如下：（1）菌丝培养：将香菇菌种转接到马铃薯葡萄糖培养基中，23℃～25℃下避光摇瓶培养，3d～4d后收集菌丝；（2）基因组DNA的提取：用CTAB法提取上述菌丝的基因组DNA，紫外分光光度法检测总基因组DNA浓度和纯度，调整样品DNA的浓度一致；（3）SSR分子标记的检测：对上述提取的DNA进行基因SSR标记的PCR扩增；PCR扩增体系为：总体积20μL，包括：10×PCR buffer2μL，25mmol/L MgCl22μL，10mmol/L dNTP0.4μL，5U/μL Taq DNA酶0.2μL，10μmol/L SSR标记正向引物和反向引物总体积各1.5μL，浓度20ng～30ng/μL提取的模板DNA2μL，ddH2O10.4μL；PCR反应条件：94℃5min；94℃30second，55℃30second，72℃30second，30个循环；72℃5min；7对SSR引物如下：Le_fp0001的正/反向引物分别为：ACGCGTATCCTCCCCTAAGT/AAGCGATATGGATTTGACGC；Le_fp0002的正/反向引物分别为：GGGCGAAACAATTTCAGGTA/ATGCCATCGTAAGGAACTCG；Le_fp0003的正/反向引物分别为：ATTGTGACTCGACCACCTCC/TCATAATGCATCCCGTGAGA；Le_fp0004的正/反向引物分别为：CCCAAAAAGGATTTCAGCAA/AACCGGAGTGGTGTAAGTGC；Le_fp0005的正/反向引物分别为：CATCAACCAAACCAAGATTCAA/TTCCAATTTCCTCCGAGTCA；Le_fp0006的正/反向引物分别为：CATGGGAGAGATTCGGAAAA/CGAGACCGACGACTTTGACT；Le_fp0007的正/反向引物分别为：CATTGCTCGGATCCTTCATT/TACCTCGTGCGGACTTTGAT；（4）电泳检测：将上述PCR扩增得到的产物与12μL加样缓冲液混匀，于95℃变性5min，结束后置于冰水混合物中冷却3min，点样3μL于变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，变性聚丙烯酰胺凝胶的体积百分比浓度为6%，电泳缓冲液为1×TBE，电压1000v，电流200mA，功率200W，电泳45min，银染，显色，拍照，分析结果；采用7对SSR引物对香菇菌株进行PCR扩增，通过对照50bp DNA ladder可确定各SSR引物扩增的等位片段的数量和相对分子量，找到符合编号组合为：1（3+4）11（1+3）22的菌种，即可确定该菌种为香菇241‑4菌种。